זיהוי נוגדן דומיין מחייב קולטן SARS-CoV-2 באמצעות ביו-דו"ח מבוסס HiBiT
Summary
הפרוטוקול המתואר מתאר את ההליך לייצור קומפלקס חלבון תחום מחייב קולטן HiBiT ויישום שלו לזיהוי מהיר ורגיש של נוגדני SARS-CoV-2.
Abstract
הופעתה של מגפת COVID-19 הגבירה את הצורך בשיטות זיהוי סרולוגיות טובות יותר כדי לקבוע את ההשפעה האפידמיולוגית של תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2). המספר ההולך וגדל של זיהומי SARS-CoV-2 מעלה את הצורך בגילוי נוגדנים טוב יותר. שיטות זיהוי הנוגדנים הנוכחיות פוגעות ברגישות למהירות או רגישות אך גוזלות זמן רב. חלק גדול מהנוגדנים המנטרלים SARS-CoV-2 מכוונים לתחום איגוד הקולטן (RBD), אחד התאים האימונוגניים העיקריים של SARS-CoV-2. לאחרונה עיצבנו ופיתחנו RBD רגיש מאוד, מתויג ביו-זוהר (NanoLuc HiBiT-RBD) כדי לזהות נוגדנים SARS-CoV-2. הטקסט הבא מתאר את ההליך לייצור קומפלקס HiBiT-RBD ובחינת הפעלה מהירה כדי להעריך את נוכחותם של נוגדנים המיועדים ל-RBD באמצעות כלי זה. בשל עמידותו של מוצר חלבון HiBiT-RBD על פני מגוון רחב של טמפרטורות ואת ההליך הניסיוני הקצר יותר שניתן להשלים בתוך 1 שעות, הפרוטוקול יכול להיחשב כחלופה יעילה יותר לזיהוי נוגדנים SARS-CoV-2 בדגימות סרום המטופל.
Introduction
הופעתו האחרונה של נגיף הקורונה החדש, SARS-CoV21, גרמה ליותר מ-2,800,000 מקרי מוות ו-128 מיליון זיהומים נכון ל-30 במרץ 20212. בשל היעדר הליך טיפול אמין ומבוסס היטב לטיפולים קליניים SARS-CoV-2, נעשו מאמצים רבים להגביל העברה ויראלית נוספת וחשוב מכך, לפתח טיפול יעיל וחזק או חיסון3. עד כה, ישנם יותר מ -50 מועמדים לחיסון COVID-19 בניסויים שדווחו על ידי ארגון הבריאות העולמי4. איתור נוגדנים נגד SARS-CoV-2 הוא בעל חשיבות עליונה לקבוע את היציבות ארוכת הטווח של תגובה הומוריסטית בעת מתן החיסון, כמו גם בחולים שהחלימו מ- COVID-195. מספר מחקרים הראו כי קיימת אפשרות כי חולי SARS-CoV-2 התאושש לאבד את רוב נוגדנים מחייב RBD לאחר שנה אחת5,6,7,8,9. דרושה חקירה נוספת כדי להבין טוב יותר את החסינות המתמשכת, ופלטפורמות רגישות יותר לזיהוי נוגדנים יכולות לסייע בהמשך עבודה כזו. דיווחים על חסינות מתמשכת של זיהומים מתונים SARS-CoV-2, המציעים תגובות נוגדנים לטווח ארוך, הוא גם תחום מחקר מעניין וכדאי. שיטת זיהוי מהירה ומדויקת חיונית לניטור נוגדנים בסרה של אנשים כדי לספק מידע נוסף על חסינות באוכלוסייה.
כמו נגיפי קורונה אחרים, SARS-CoV-2 משתמש בגליקופרוטאין ספייק בולט כדי להיקשר לאנגי-טנסין-ממיר אנזים-2 (ACE2) כדי ליזום מפל של אירועים שמובילים להיתוך של קרום הנגיפי והתא6,7. מספר מחקרים הוכיחו לאחרונה כי ל-RBD של חלבון ספייק יש תפקיד מכריע בהצתת תגובת נוגדנים עוצמתית וספציפית נגד SARS-CoV28,9,10,11. בפרט, קורלציות שנצפו על ידי Premkumar ואח ‘ בין titer של נוגדן מחייב RBD ועוצמה נטרול SARS-CoV-2 של פלזמה של חולים עולים בקנה אחד עם RBD להיות תא אימונוגני של מבנה הנגיף9. עם זאת, בדיקות אבחון רבות הזמינות לזיהוי נוגדנים SARS-CoV-2 הן זמן ועלויות אינטנסיביות, דורשות הליך ממושך של דגירה ושטיפה (בדיקת חיסונים הקשורה לאנזים [ELISA]), או חוסר רגישות ודיוק (אימונואוסי זרימה לרוחב [LFIA])12. לכן, שיטה סרולוגית משלימה כמותית ומהירה של זיהוי נוגדנים שמקורו ב- COVID-19 עם רגישות גבוהה, תגובה מהירה ועלות נמוכה יחסית תשרת את הצורך בבדיקה סרולוגית אמינה למעקב אפידמיולוגי SARS-CoV-2.
באופן קולקטיבי, המגבלות של הבדיקות הסרולוגיות הנוכחיות הובילו לחקירת מערכת הדיווח הביו-זוהרת כסוכן אבחון פוטנציאלי בסרוסוריים עתידיים. ביולומינציה היא תגובת אנזים/מצע טבעית, עם פליטת אור. Nanoluc לוציפראז הוא הקטן ביותר (19 kDa), עדיין המערכת הבהירה ביותר בהשוואה רנילה ולוציפראז גחלילית (36 kDa ו 61 kDa, בהתאמה)13,14. יתר על כן, Nanoluc יש את יחס האות לרעש הגבוה ביותר ויציבות בין המערכות שהוזכרו קודם לכן. עוצמת האות הגבוהה של Nanoluc תומכת בזיהוי כמויות נמוכות מאוד של היתוך כתבים15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) היא גרסה מפוצלת של מערכת Nanoluc, המורכבת משני מקטעים: BiT קטן (11 חומצות אמינו; SmBiT) ו- BiT גדול (LgBiT) עם אינטראקציות זיקה נמוכה יחסית (KD = 190 מיקרומטר ) כדי ליצור קומפלקס זוהר16. NanoBiT נמצא בשימוש נרחב במחקרים שונים הכוללים זיהוי של אינטראקציות חלבון חלבון15,17,18,19 ומסלולי איתות תאיים11,20,21.
לאחרונה, פפטיד קטן נוסף עם זיקה גבוהה יותר באופן מובהק LgBiT (KD = 0.7 nM) הוצג, כלומר מערכת HiBiT Nano-Glo, במקום SmBiT. הזיקה הגבוהה והאות החזק של ננו-גלו “להוסיף-לערבב-לקרוא” אסאי עושה HiBiT מתאים, כמותי, תג פפטיד זוהר. בגישה זו, תג HiBiT מצורף לחלבון היעד על ידי פיתוח מבנה המטיל הפרעה מבנית מינימלית. היתוך חלבון HiBiT ייקשר באופן פעיל למקבילו LgBiT, ויפיק אנזים לוציפראז פעיל מאוד כדי ליצור ביו-לומינציה הניתנת לזיהוי בנוכחות ריאגנטים לזיהוי (איור 1). באופן דומה, פיתחנו מערכת מבוססת HiBiT Nano-Glo כדי למדוד בקלות את טיטר הנוגדנים המנטרל בסרה של אנשים שהתאוששו SARS-CoV-2 ולאחרונה פיתחנו RBD SARS-CoV-2 מתויג HiBiT. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לייצור bioreporter HiBiT-RBD באמצעות נהלי מעבדה סטנדרטיים וציוד, ומראה כיצד ניתן להשתמש ב- bioreporter זה בבוחן מהיר ויעיל לזיהוי נוגדנים המיועדים ל- SARS-CoV-2 RBD.
Protocol
Representative Results
Discussion
המספר ההולך וגדל של אנשים שנדבקו ב- SARS-CoV-2 והמאמץ המתמשך לחיסון גלובלי מחייבים בדיקות סרולוגיות רגישות ומהירות שניתן להשתמש בהן בסרוסוריבים בקנה מידה גדול. מחקר שנערך לאחרונה מראה כי bioreporters מבוסס ננו-לוציפראז מפוצלים ניתן להשתמש כדי לפתח מותנים כאלה. לאחרונה פיתחנו את הביו-דו”ח HiBiT-RBD כדי ל…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מעריכים ומודים לסיוע הטכני של שיאוהונג הוא, ריקרדו מריוס, ג’וליה פטריק, בראדלי אוסטין וכריסטיאנו טאנזה דה סוזה. אנו מודים גם למינה גהרמני על עיצוב גרפי. ברצוננו גם להודות לכל האנשים שהשתתפו ותרמו את דגימות הדם שלהם למחקר זה. DWC נתמך בחלקו על ידי הפקולטה uOttawa והמחלקה לרפואה.
Materials
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
Referencias
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021)
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021)
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021)
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase – a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
