Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Hannes Feyrer; Judith Schlagnitweit; Katja Petzold

doi:10.3791/62470

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Bioquímica

RNA의 1 H R _1θ 이완 분산 실험의 샘플 준비 및 설치의 실제적인 양상

Published: July 09, 2021

doi:

10.3791/62470

Hannes Feyrer¹, Judith Schlagnitweit¹, Katja Petzold¹

¹Department of Medical Biochemistry and Biophysics,Karolinska Institutet

Summary

우리는 ¹³C/ ¹⁵N 라벨 및 1 H R_1θ 이완 분산 핵 자기 공명 (NMR) 분광기로 표시되지 않은 RNA에 마이크로 밀리초 역학을 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 초점은 NMR 실험의 고순도 샘플 준비 및 설정에 있습니다.

Abstract

RNA는 매우 유연한 생체 분자이며, 구조의 변화는 RNA 분자가 세포 메신저 및 변조기로 실행되는 기능에 중요한 역할을합니다. 이러한 동적 상태는 대부분의 구조적 방법에 숨겨져 있지만, R_1θ 이완 분산 (RD) 분광법은 원자 해상도에서 마이크로 – 밀리초 정권의 형성 역학의 연구를 할 수 있습니다. 관찰된 핵으로서 ^1H를사용하면 적용된 시간 정권이 더욱 확장되고 수소 결합 및 기본 페어링에 직접 접근할 수 있습니다.

이러한 연구에서 도전적인 단계는 고순도 및 고수율 샘플 준비, 잠재적으로 ¹³C- 및 ¹⁵N 라벨뿐만 아니라 이전에 보이지 않는 상태의 인구, 환율 및 이차 구조를 추출하기 위한 실험 및 데이터의 피팅 설정입니다. 이 프로토콜은 동위원소 표지 및 라벨이 부착되지 않은 RNA 샘플을 모두 사용하여 ¹H R_1θ 실험의 적절한 RNA 샘플 및 설정의 준비를 보장하기 위해 샘플 준비에 중요한 실습 단계를 제공합니다.

Introduction

RNA는 다수의^조절1,촉매^2,및 세포내 구조³ 기능을 수행하며, 이들 중 상당수는^4,^5,^6,^7의유연한 분자 구조와 복잡한 변화와 상관관계가 있다. 낮은 인구 주 구조 결정의 대부분의 방법에 보이지 않는 남아 또는 높은 원자 해상도에서 이러한 숨겨진 상태의 연구를 허용하지 않습니다. 솔루션 상태 핵 자기 공명(NMR) 분광기는 개별 원자 핵에 대한 액세스를 제공하고 모든 시간 정권^8을통해 역학을 대상으로 하는 대규모 실험 도구 상자를 제공함으로써 두 측면을 결합합니다. RD NMR 실험은 중간 시간대에 형성 교환에 대한 액세스를 제공하며, 여기서 기본 페어링 패턴 및 국소 구조 재배열의 변화는^5,^9,^10,^11,^12,^13,^14를예상할 수 있다. RD 실험은 Carr-Purcell-Meiboom-Gill 펄스^{트레인(15)의} 형태로 긴_R2 측정또는 회전 프레임에서 이완 측정으로 수행되며, R_1θ RD^{실험(16)이라고}불린다.

둘 다 소국가에 대한 인구와 환율 및 화학적 변화 차이를 추출하는 데 사용될 수 있지만, R_1θ RD 실험은 또한 흥분 상태의 화학적 변화 차이의 징후를 준다. 이것은 RNA^{구조물17의}화학적 변화와 강하게 상관되는 이차 구조물에 대한 추론을 허용한다. 화학적 변화는 뉴클레오베이스에 방향족 양성자와 탄소의 경우, 이미노 양성자에 대한 기본 페어링 파트너, C4및 C1의 원자^18,^19에설탕 퍼커의 경우 헬리시티의 좋은 지표이다. 최근에는 더 높은 스핀 락(SL) 전력을 이용한 화학교환 포화전달(CEST) 실험을 통해 CEST 실험의 적용가능성을 더 빠른 교환 시간대로 전환하여, 하나의 흥분된 상태를 가진 시스템에 대한 R_1θ RD 실험의 대안으로 공표되었다는 점에 유의해야 한다.

¹³C 및 ¹⁵N 동위원소는 종종 구조 교환에 액세스하는 데 사용되었지만,이 실험실에서 최근 작업은 형성 교환^9,^10에대한 프로브로 방향족과 이미노 양성자를 사용했다. 관찰된 핵으로서 ^1H를사용하면 몇 가지 장점이 있습니다(예: 더 빠르고 느린 시간 척도, 더 높은 감도 및 더 짧은 측정 시간에 교환할 수 있는 액세스) 등이 있습니다. 이는 SELective 최적화 양성자 실험(SELOPE) 접근법에 의해 더욱 촉진되며, 이종핵 자화 전달 대신 호모핵 스칼라 커플링을 사용하여 1차원(1D) 스펙트럼의 탈밀을 통해 방향족 양성자에 대한 접근을 제공하고, 동위원소^{라벨(20)의}필요성을 제거한다. 이 프로토콜은 균일하게 ¹³C/ 15 N 라벨 및 레이블이 없는 샘플의 ¹H R_1θ RD 실험에서 측정을 다룹니다. 따라서, 본 백서는 상이한 샘플 준비^{요구(21)에} 대해 가장 다재다능한 것으로 밝혀진 샘플 준비 방법을 제시하고, 본 문서의 마지막 섹션에서 대안을 논의한다(도1).

이 시점에서, 판독기는 다른 샘플 준비 기법이 ¹H R₁ RD 실험에 허용되며, 다른 구조 및 기능 분석 방법은 제시된 기술로 합성된 샘플로 수행될 수 있다는 점에 유의해야 한다. ¹ H R_1θ RD 실험은 분자 역학의 신뢰할 수 있는 특성을 보장하기 위해 RNA 길이와 구조적 형태 모두에서 높은 RNA 농도(이상적으로 >1mM)뿐만 아니라 높은 균질성을 필요로 한다. 시험관 내 전사(IVT)는 많은 연구자들이 ^13C/15N-표지 RNA 시료를 제조하는 데 선택되는 방법은 표기된 뉴클레오시드 삼위산염(NTPs)의 가용성으로 인해 효소^{반응(22)에서}의 편성편성이다. 그러나, 널리 사용되는 T7 RNA 폴리머라제(T7RNAP) (T7RNAP)^(23,^24,^25)는 특정 개시 서열(26,^27)의 경우 낮은 5′ 균질성을 앓고 있으며, 또한 전사유출(28)에서 3’균질성을 겪는다. 표적 RNA 종의 정제는 ~200 nmol의 다량의 필요성으로 인해 더 비싸고 힘들어집니다. 여기에 사용된 방법은 이전에 큰^21에서장점이 논의된 곳에서 제시되었습니다. 간단히 말해서, 그것은 다음 사이트-구체적으로 cleaved 에세리치아 대장균 RNase H에 의해 갈라진 더 큰 탠덤 성적 증명서를 전사 하 여 설명 된 문제를 해결, 키메 라 고 뉴 클레 오 티 드에 의해 유도^29,³⁰ (자세한 내용은 그림 2 참조).

탠덤 전사체의 5′ 및 3’끝에 스페이서 서열을 통합하면 플라스미드 템플릿의 선형화 부위에 가까운 터미널 오버행의 고수량 개시 서열 및 제거를각각(도 2B)할수 있다. 이 방법은 비용과 노동력을 줄이면서 수율을 크게 개선하는 것으로 나타났으며, 보다 복잡한 템플릿 합성의 주의와 추가 효소 및 올리고뉴클레오티드의 필요성이 있는 것으로 나타났다. RNase H 분열의 높은 특이성은 유사한 크기 범위에서 RNA 종의 부족으로 인한 정제를 용이하게한다. 본 프로토콜은 다른 방법이 가능한 대안이지만 최근^31이실험실에서 발표 한 이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 단계를 사용합니다. ¹ H R_1θ RD는 일반적으로 각각 의 두 펄스 서열을 가진 라벨이 부착되거나 레이블이 없는 샘플, 1H R_1θ 이성핵 단일 양자 상관관계(HSQC)-13C 간접치 10및 “1HR _1selOPE 기반 실험을 ^1H간접 차원^20으로 분류할 수 있다.

이러한 2차원(2D) 실험은 Rθ 기간척도의 역학이 샘플에 존재하는지 여부에 관계없이 첫 번째 검사역할을 할 수 있습니다. 스펙트럼의 모든 해결된 피크에 대한 RD 개요를 얻을 수 있으며 보다 철저한 RD 분석에 대한 관심의 피크를 확인할 수 있습니다. 즉, 라벨이 부착되지 않은 샘플조차도 더 비싸고 라벨이 부착된 샘플을 생산하기로 결정하기 전에 확인할 수 있습니다. 변형 교환 기여도가 더 철저하게 연구되도록 선택되면, 소위 공진 실험을 수행하기 위해 위의 실험의 1D 버전으로 전환하는 것이 가장 좋습니다. 라벨이 부착된 버전의 경우, HSQC 는 ^13C R_1θ 실험^32, ^33,^34,^35에사용되는 선택적 이성핵 교차 편광(HCP) 단계로 대체되며, SELOPE 실험의 경우, 실험은 단순히 1D로 실행되며, 이는 특히 H8 및 H2 신호에 대한 데 유용하다. 라벨이 부착된 샘플과 레이블이 지정되지 않은 샘플을 사용할 수 있는 경우 사용할 순서에 대한 한 가지 기준은 관심의 피크가 두 실험에서 얼마나 잘 격리되어 있는지입니다.

일반적으로 SELOPE 실험은 최대 50개의 뉴클레오티드의 RNA 샘플에 권장됩니다. 더 큰 RNA의 경우 중복이 더 커집니다. 그러나, 구조적으로 흥미로운 뉴클레오티드는 종종 덜 겹쳐지고 여전히 더 큰 RNA에서 접근할 수 있는 화학 교대 지역에서 나타납니다. 라벨이 지정되지 않은 샘플에서는 J-커플링이 ^1H에서 ^12C사이에 발생하지 않는다는 또 다른 논쟁이 있습니다. 그러나 최소 스핀 잠금 전력은 레이블이 지정된 실험에서 두 개의 스핀(~1kHz)을 분리하는 데 사용되는 최소 전력에 의해 정의되므로 레이블이 지정되지 않은 실험은 더 넓은 범위의 스핀 락(SL) 강점을 사용할 수 있으므로 더 넓은 범위의 교환 기간에 액세스할 수 있습니다. 이러한 공진 실험은 흥분 상태의 인구(대체 원포), p_ES, Δω의 형태로 매우 귀중한 화학적 변화 정보(지상 상태 및 흥분 상태의 화학적 변화 차이)와 같은 k_ex에추가 정보를 제공한다.

그림 1: 제시된 프로토콜의 워크플로우입니다. 실제 대규모 샘플 생산 전에 준비, 템플릿 준비 및 성공적인 시험관 내 전사 및 RNase H 분열의 확인으로 구성. HPLC 정화, NMR 튜브 충전, RNA 접이식 확인 을 포함한 대규모 생산. 동위원소 라벨 합성의 경우, 같은 날 그라데이션 최적화를 위해 라벨이 부착되지 않은 정제를 수행해야 합니다. R_1θ 실험을 통해 형성 역학의 NMR 특성화. 각 단계는 독립적으로 수행될 수 있다, 예를 들어, ¹H_R1θRD 분석은 다른 방법으로 생성된 임의의 적합한 RNA 샘플에 적용될 수 있다. 약어: IVT = 시험관 내 전사; HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피; NMR = 핵 자기 공명; RD = 이완 분산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 프로토콜의 목적은 RNA 헤어핀 분자에서 ¹H R_1θ 이완 분산을 가진 형성 역학의 연구를 위한 실제적인 세부 사항 및 중요한 매개변수를 제공하는 것입니다. 설계, 합성 및 이온 교환 HPLC 정제의 상세한 프로토콜을 제공 한 후 모든, 일부, 또는 없음 NTP를 ¹³C/¹⁵N 라벨 버전으로 사용하여 수행 될 수있는 표적 RNA의 정제, NMR 샘플을 마무리하고 NMR 분광법을 사용하여 형성 교환을 확인하는 워크플로우가 설명되어 있다. 마지막으로, 브루커 NMR 분광계에 ^{대한 1H} R_1θ RD 실험의 설정에 대한 세부 사항이 설명되어 있다(그림1). 이 프로토콜은 각 단계에서 레이블이 지정된 샘플및 추가 주석및 셀OPE버전(표 2)의설정에 맞게 조정할 테이블을 설정하는 1D 버전을 설정하는 데 제공합니다. 프로토콜 이후에는 샘플링 준비와 ^1H R1_RD 설정에 대한 중요한 단계 및 대체 경로에 대해 설명합니다.

Protocol

도 2: 보고된 탠덤 IVT 프로토콜의 회로도 표현. (A)T7RNAP(왼쪽)를 가진 선형화된 플라스미드 템플릿으로부터의 탠덤 전사및 미취록 DNA 가이드(오른쪽)에 의해 지시된 표적 길이 RNA를 달성하기 위해 성적증명서의 RNAse H에 의한 연속분열이 있다. (B)바이러스 성 T7RNAP 프로모터, 개시 서열로 시작하는 탠덤 템플릿의 상세한 회로도. 대상 시퀀스(진한 파란색, 예는 20nt 길이)가 “n” 번 반복된다. 반복에 의해 측면 5′ 그리고 3′ 스페이서 서열 마지막 8 및 처음 네 뉴 클레 오 티드로 구성, 각각, 첫 번째와 마지막 반복 단위에서 개시 및 제한 서열의 제거를 허용 하기 위해. (C)탠덤 전사체(red)와 키메라 분열 가이드(녹색)의 혼성화. RNase H는 DNA 5′ 끝에 반대RNA를 떠난다. 2′-OMe RNA 측면은 표적 RNA에 분열 가이드의 결합 친화성을 강화하여 특이성을 증가시킵니다. 이 그림은 21에서수정되었습니다. 약어: T7RNAP = T7 RNA 폴리머라제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 1. 새로운 RNA 구성을 위한 작업 준비 플라스미드 디자인 및 준비 템플릿 시퀀스를 복제 도구(예:., Serial Cloner)에 작성합니다. T7 프로모터 서열을 가지고 고수성 개시 시퀀스를 추가하십시오(T7: 5′-TAATACGACTCACTATA ^GGGAGA-3′).참고: 전사는 카레 (^)로 표시된 뉴클레오티드에서 시작됩니다. 개시 시퀀스 GGGAGA는 가변적이지만 시퀀스에 따라 크게 달라집니다. 따라서 이 시퀀스를 사용하는 것이 좋습니다. 표적 서열의 마지막 8개의 뉴클레오티드(nt)를 5′ 스페이서(5’S)로 추가한다. TS(대상 시퀀스)의 반복을 추가합니다. 처음 네 개의 뉴클레오티드를 반복 후 3’스페이서로 추가합니다(5’S). BAMHI 제한 사이트(RS) 또는 이와 유사한 고유 제한 사이트를 추가합니다.참고: 표시된 총 시퀀스는 세균성 고복사 플라스미드(예: pUC19)에서 복제되거나 쉽게 주문됩니다: 5′-T7-5’S-(TS)n-3’S-RS-3′(그림2B). 반복의 수는 유전자 합성에 의해 허용되는 만큼 높어야한다 (이 프로토콜에서 최대 600 nt). 상용 키트를 사용하여 대장균의 플라스미드를 증폭시합니다. 적절한 제한 부위를 사용하여 20 ng/μL에서 정제된 플라스미드를 선형화합니다. 최대 1mL까지 BamHI로 스케일 제한 소화. 소화된 플라스미드를 정화하고, 1% 아가로즈 젤로 성공적인 선형화를 확인합니다. 선형 플라스미드를 -20°C에서 몇 달 동안 저장합니다. 골짜기 가이드 디자인(도 2C) 표적 RNA 서열의 마지막 8개의 뉴클레오티드를 5′-3′ 방향으로 적시고, 표적 RNA 서열의 처음 4개의 뉴클레오티드를 3’말단에도 5′-3′ 방향으로 첨가한다. 해당 서열의 역DNA 보완생성 뉴클레오티드 문자 전에 ‘m’을 추가하여 2’-OMe 수정으로 첫 번째 및 마지막 네 개의 뉴클레오티드를 변경합니다.참고: 합성의 경우 mT 대신 mU가 사용됩니다. 표준 탈염 정제로 올리고를 주문하십시오.참고: 생성된 올리고가 두 RNA 서열의 연결 이외의 다른 장소에서 결합할 수 있는지 확인합니다. 중앙 4개의 DNA 뉴클레오티드에 있는 완전한 보완성은, 측면 지역이 불일치를 허용할 수 있는 동안 요구됩니다. 필요한 경우 측면을 최대 18nt로 확장하여 고유한 바인딩시퀀스(36)를생성합니다. 소규모 IVT참고: RNase 가 없는 작업의 경우 멸균 및 RNase 가 없는 조건에서 모든 시약을 준비하십시오. RNase 오염 제거 시약(재료 표참조)과 95% v/v 에탄올을 사용하여 사용하기 전에 작업 표면과 파이펫을 청소하십시오. 95% 에탄올로 장갑을 씻고 보풀이 없는 긴소매 옷을 입습니다. RNase 오염을 최소화하려면 열린 튜브를 통해 호흡하지 마십시오. Tris-Cl(pH 8.0), 디티오트리톨, MgCl2,스미디딘 및 NTP/GMP(버퍼링되지 않은)의 재고 솔루션을 준비합니다. 표 1에표시된 대로 시약을 혼합합니다. 효소 또는 핵산을 첨가하기 전에 이러한 시약의 마스터 믹스를 미리 준비하십시오.참고: 냉동 시약을 사용하는 경우 해동 후 철저히 섞습니다. 너무 높은 농도로 혼합하면 시약이 침전될 수 있으므로 표 1의순서를 따르는 것이 좋습니다. 플라스미드, 골짜기 가이드, 무기 인산염(IPPase), RNase H, T7RNAP: 다음 순서에 추가합니다. 효소 활성은 사내에서 생산되는 효소에 따라 다를 수 있으므로 최상의 것을 선택하기 전에 여러 농도를 테스트합니다.참고: 누락된 목표 대역을 결함이 있는 RNase H 분열로 특성화하고 실패한 전사가 아니라 RNase H없이 분열 반응에 대한 음의 제어를 포함합니다. 반응을 37°C에서 1h로 배양하고, 탈질 폴리아크릴아미드 겔 전기포에 대한 반응을 확인한다(PAGE)(도 3A). 로딩 용액에서 샘플을 10배 희석하고 1 μL을 젤에 적재합니다.참고: 젤 혼합물: 8 M 우레아, 20% 아크릴아미드 (19:1 아크릴라미드: 비사크라이알라미드) 1x TBE. 적재 용액: 5 mM 에틸렌디아민 테트라아세틱산 (EDTA), 포르마미드의 300 μM 브로모페놀 블루. RNase H 분열 반응은 새로운 RNA가 지속적으로 생성되기 때문에 1 시간 후에 완료될 것으로 예상될 수 없습니다. 이 시점에서, 명확한 표적 대역과 유사한 분자량의종(예를 들어,±3 뉴클레오티드(nt) 제품)의 부재를 찾아본다. 시약 재고 농도 양 소량(μL) H2O – 24 트리스 (주) 1 M 5 MgCl2 1 M 0.5 DTT 1 M 0.5 스미디딘 250 mM 5 GMP 100mM 2.5 ATP 100mM 1.5 GTP 100mM 1.5 UTP 100mM 1.5 CTP 100mM 1.5 플라스 미드 20 ng/μL 5 분열 가이드 100 μM 10 아이파스 10 mg/mL 0.5 RNase H 10 μg/mL 2 T7 RNA 폴리머라제 5 mg/mL 2 표 1: 탠덤 IVT 및 동시 RNase H 분열용 시약 표. 재고 농도는사용자의편의에 맞게 조정할 수 있습니다. RNase H 분열은 T7 IVT 후에 수행되어야 하는 경우, T7RNAP의 열 비활성화 후 분열 가이드와 RNase H를 추가합니다. 반응 스케일로 선형으로 스케일을 사용했습니다. 약어: T7RNAP = T7 RNA 폴리머라제; IVT = 시험관 내 전사. 2. NMR 샘플 준비 원하는 부피(일반적으로 10mL)에 대한 반응을 확장하고 밤새 반응을 실행합니다. 다음날 에 반작용을 위한 시험은파3A(그림 3A)로한다.참고: 불완전한 분열 반응은 표적 대역 위의 더 높은 분자량 종에 의해 도시된다. 골짜기가 성공적이지 않거나 완전하지 않은 경우, 15s에 대한 종래의 전자레인지에서 용액을 가열하여 반응 용기내의 RNA 및 분열 가이드를 재장음한다. 용액을 37°C로 천천히 식히면 40분간 냉각하십시오. 1mL 이하의 볼륨에 가열 블록을 사용합니다. 새로운 침전물의 형성에 유의하십시오. IPPase 및 RNase H를 더 추가하고 37°C에서 1-3h의 추가 배양을 합니다. 부정 페이지로 분열 반응의 완성을 확인합니다. RNase H 분열 반응이 완료되면, EDTA를 50mM 최종 농도에 첨가하여 반응을 담금질하고 소용돌이를 철저히 한다.참고: 잠재적인 파이로포스페이트 침전은 용해되고 새로운 단백질 침전물 형태가 용해됩니다. 0.2 μm 주사기 필터를 통해 용액을 필터링하고 주입 루프 크기에 따라 HPLC 시스템에 주입 가능한 부피에 집중합니다.참고: 프로토콜은 -20°C에서 샘플을 동결하여 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 대규모 HPLC 정화 사용 후 1주일 이내에 이온 교환 버퍼 A와 B를 준비합니다. 버퍼를 필터링하고 탈가스합니다.참고: 버퍼 A: 20 mM 나트륨 아세테이트; 20mM 나트륨 과염소산나트륨, pH 6.5. 완충 B: 20mM 나트륨 아세테이트; 600 mM 나트륨 과염소산나트륨, pH 6.5. 100% 버퍼 B로 컬럼을 한해, 75°C에서 2개 이상의 열 볼륨에 대해 100% 버퍼 A가 됩니다. HPLC 서열(도3B)을5.5mL/분의 유속도로 준비한다. 20 내지 30 nt 사이의 크기의 RNA의 정제를 위해 다음 순서를 사용: 0-7 분: 0% B; 7-16 분: 그라데이션 0-20% B; 16-46 분 : 용출, 일반적으로 20-30 % B의 그라데이션 (필요에 따라 최적화); 46-62 분 : 100 % B; 62-73 분 : 0 % B.참고: 유량의 변동률이 5.5mL/min으로 변경되어 이 프로토콜의 분리에 영향을 미치지 않았습니다. 한 번에 1mL의 전사 반응(레이블 이없음)에 상응하는 주입에 의해 용출 그라데이션을 최적화합니다.참고: 자세한 내용 및 토론은 칼슨 외31 및 페이어 외21을참조하십시오. 모은 분수를 데스팅 페이지에서 테스트합니다. 주 용출 피크가 잘 절연되어 순수한 표적 RNA를 포함하는 경우, 10 mL의 전사 반응에 상응하는 정제를 확장한다. 관심의 분수를 수집하고, 버퍼를 NMR 버퍼로 농축하고 교환합니다. 50mL 이상의 볼륨에 대해 초원심 필터 장치(재료 표참조)를 사용합니다.참고: NMR 버퍼: 15 mM 인산 나트륨; 25 mM 염화 나트륨; 0.1 mM EDTA, pH 6.5. 플라스틱 튜브 벽에 대한 RNA 준수에서 손실을 최소화하기 위해 모든 수집 튜브를 물, 소용돌이 및 원심분리기로 세척하여 모든 액체를 수집합니다. 자외선 분광기를 통해 농도를 결정합니다. Feyrer 외21에따라 반응 수율을 계산합니다.참고: Rd 실험을 위한 NMR 샘플의 농도는 NMR튜브(재료 표)를사용하여 250 μL의 샘플 부피에서 500 μM에 해당하는 130nmol 미만이어야 합니다. RNA 샘플접기 튜브당 1mL로 ~10mL의 부피 샘플을 희석하고 알리쿼트합니다. RNA 알리쿼트를 95°C로 5분 동안 가열합니다. 얼음이나 물 얼음 소금 혼합물에 넣어 샘플을 스냅 식히고 30 분 동안 배양하십시오. 2mL 원심 필터 유닛에서 ~250 μL에 농축합니다. NMR 튜브 충전 풍부한 물, RNase 제염 시약, 물, 95 % 에탄올 (EtOH), 물 다시 플러시하여 NMR 튜브 클리너에서 NMR 튜브를 청소하십시오. 말리십시오. 물로 헹구고 RNase 오염 제거 시약으로 닦아 플런저를 청소하고 95% EtOH는 보풀이없는 닦아냅니다. 말리십시오. NMR 샘플에 D2O의 10%(v/v)를 추가합니다. RNA 샘플을 큰 파이펫 팁을 사용하여 NMR 튜브로 채웁니다. 액체가 튜브 벽의 측면을 따라 흐르게 하십시오. 플런저를 삽입하고 빠른 비틀기 모션과 함께 플런저를 아래로 밀어 기포를 제거합니다. 새로운 기포를 만들지 않고 플런저를 천천히 당기고 파라핀 왁스 필름으로 고정하십시오. NMR에 의해 접는 지 확인합니다.참고: 이 시점에서, RNA 샘플의 이차 구조를 확인하고 형성 역학연구를 위한 관심 영역을 식별하기 위해 적어도 부분 공명 할당을 수행해야 합니다. RNA 공명 할당에 대한 철저한 설명은 이 프로토콜을 초과하므로 이 시점에서 잘 확립된 문헌을 참조합니다19,37,38. 전기 전광 이동성 이동 분석(EMSA)은 RNA 접이식의 유용한 지표가 될 수 있으며 NMR 실험에 대한 보완 데이터역할을 할 수 있습니다. 1H R1θ RD 실험이 제대로 접힌 참조 샘플(도4): 1H 1D, 특히 이미노 영역 10 ~ 15 ppm으로 수행되는 샘플의 다음스펙트럼을비교합니다. 방향족 1H,13C-HSQC; 1 H,1H-셀로페 (선택 사항).참고: 이머 형성은 종종 RNA 헤어핀과 동일하거나 유사한 이미노 신호를 나타내기 때문에, 이미노 신호 사이의 합의의 경우에도 방향족 지문도 필요합니다. SELOPE 실험은 라벨이 없는 샘플에 대한 이종핵 실험이 매우 시간이 많이 걸리기 때문에 방향족 지문에 대해 1H,13C-HSQC를 대체할 수 있습니다. UUCG 루프를 지문 참조로 사용합니다(있는 경우). 1H R1θ RD 실험이 기록되기 전에 매번 이 비교를 수행합니다. 3. 1H R1θ 휴식 분산-공명 (라벨 1D 버전) 참고: 아래 단계는 HSQC 기반 RD 펄스 서열의 1D 버전을 사용하여 레이블이 부착된 샘플에 대한 RD 실험 설정을 설명합니다. 레이블이 지정되지 않은 샘플에 대해 SELOPE 기반 1D 시퀀스에 대해 동일한 단계를 따릅니다. 두 사례에 대한 매개 변수 이름 및 설정에 대한 개요는 표 2에표시됩니다. 1D 버전에 대한 초점은 오프 공명 측정에 더 실용적이기 때문에, SELOPE 및 HSQC 기반 실험의 2D 버전의 설정은 각각 슐라그니트 바이트 외20 및 Steiner 외10에의해 자세히 논의되었다. 하드 90° 펄스(P1)에 대해 1H전력을 결정합니다. 옵션 A: 브루커 펄스칼 명령을 사용합니다. 옵션 B: zg 실험에서, 물 피크에 양성자 하드 펄스 전력 수준에서 견과류 곡선을 측정하여 360° 펄스를 결정합니다.참고: 90° 펄스 길이는 0 신호가 관찰되는 지속 시간의 네 번째입니다(전체 너트 커브가 측정되는 경우, 실제로는360°에 대한 예상 값 주위의 영역만 샘플링됩니다). 모든 R 1θ 측정 전에 RNA 접이식을 확인하기 위해 3.1 단계에서 결정된 펄스 길이를 사용하여 1H1D 스펙트럼 zgesgp.f2f3dec를 실행한다.참고: 1HSL 실험이 처음으로 실행되는 경우 계산된 SL 전력이 원하는 각 대역폭에 대해 SL 전력을 보정하여 샘플에 전달되는 전력에 해당하는지 확인합니다. 상세한 교정 단계는 Steiner 외10에설명되어 있습니다. 레이블이 지정된 데이터 집합에 대해 1H R1θ를 만들고 키 매개 변수를 설정합니다. 새 데이터 집합만들기; RNA 할당을 위해 완전히 표지된 RNA 샘플에 사용되는 1H-13C 방향족 HSQC 데이터 세트를 이상적으로 기반으로 합니다.참고: 이렇게 하면 13C와 15N전원 및 분리 전력이 이미 설정되어 있습니다. 표 2의첫 번째 부분에 따라 일반 매개 변수를 설정합니다. 표 2의두 번째 부분에 따라 RD 별 매개 변수를 설정합니다. 테스트를 위해 H SL 전력을최저 값(1.2kHz)으로 설정합니다. 하나의 항목으로 테스트 vd 목록을 생성, 0 ms, (단계 3.4에 설명 된 대로 vD 목록을 최적화하기 위해), TDF1을 1로 설정하고 D30을업데이트합니다. 이러한 설정으로 테스트 스펙트럼을 실행합니다. VD 목록(사용할 SL 길이 목록)을 최적화합니다. 테스트 VD목록(예:0m, 5m, 10m, 20m, 30m, 40m) 시험 VD 목록으로 실험을 실행하여 가열로 인한 체계적인 오류를 피하기 위해 이러한 값을 스크램블합니다. D30 및 TDF1을 그에 따라 업데이트합니다(이 예에서는 D30 = 42m 및 TDF1 = 6). 피크 대 SL 길이의 플롯 강도. 원래 피크의 강도가 1/3로 감소하는 SL 길이를 식별합니다. 다음을 고려하여 실험에 사용할 최종 VD 목록을 만듭니다. 순서가 줄거나 오름차순이 있는 목록을 사용하지 마십시오. 통계 연구에 대한 몇 가지 중복을 추가합니다. VD 목록에 변경 사항이 있을 때마다 D30 및 TDF1을 업데이트해야 합니다.참고: 실험은 의사 2D 방식으로 vd 목록에 지정된 것과 같이 다른 SL 길이로 실행됩니다. 목록의 가장 약한 피크에 최소 10의 신호 대 잡음 비율(SINO)이 있도록 검사 수를 선택합니다.참고: vd 목록은 낮은 SL 전력(1.2kHz)에 최적화되었지만 이 vd 목록은 사용할 가장 높은 SL전력(예:15kHz)에서 테스트해야 합니다. 이는 상당한 kEX 기여도가 있는 피크의 높은 SL 전력에서 부패가 훨씬 느려질 것이기 때문입니다. 따라서 높은 SL 전력에서도 충분한 감쇠를 검증해야 합니다. 매개 변수 설명 펄스 시퀀스의 매개 변수 이름 라벨이 부착된 1D 1D 셀로페 공진 1D용 펄스 프로그램 1HR1rho_HCP_onres1D.es 1HR1r_HH_onres1D.js 1 H 캐리어 주파수 (ppm) O1P = ppm의 물 공명 O1P = 관심피크의 화학적 변화(ppm) CNST28 = 관심피크의 화학적 변화(ppm) CNST29 = ppm의 물 공명 1 H 하드 90º 펄스 P1 @ PL1 (3.1.1에서 보정) P1 @ PL1 (3.1.1에서 보정) 물 억제를 위한 모양의 펄스 및 힘 P25 = 1000 우리 @ sp3 P12 = 2000 우리 @ sp1 (워터게이트) (여기 조각) 13 C 캐리어 주파수, 13C 화학 적 변화의 공진 O2P – 15 N 캐리어 주파수, 분리에 대한 평균 15N 화학 적 변화 (방향족 HSQC에 사용되는) O3P – 13 C/15N 분리 (HSQC에서와 같이 설정) pcpd2, cpd2 – pcpd3, cpd3 HCP 전송(예: p=1/J @ 100Hz) – 펄스 및 펄스2 명령은 하드 펄스의 힘을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 관심의 피크의 지속 시간 (1 / J(1H -13C로 설정) P11 파워 1H 및 전원 13C SP1, SP12 셀로페 전송 (d = 1/4J(H5-H6)) – D5 셀로페에 대한 선택적 펄스(예: 방향족 영역) (4000 우리, 에버프) – P13 및 SP4 SL / RD 별 매개 변수 : 1 H SL 전력은 보정된 하드 펄스(예: 펄스 명령을 사용하여)로부터 얻은 전력입니다. Pl25 및 CNST12 (1.2 – 15 kHz) Pl24 (50Hz – 15kHz) SL 지속 시간에 대한 가변 지연 목록(처음에는 항목 1개, 0, 3.1.3 미만의 최적화) vdlist (~ 0 – 40 ms) vdlist (~ 0 – 라벨이 없는 샘플의 낮은 R2로 인해 150 ms) VD 목록의 TDF1 항목 수(처음 1개) TDF1 TDF1 열 보상: D30 = vd 목록에서 가장 큰 값 + 2ms D30 D30 매우 광범위한 SL에 대한 추가 열 보상 PL25 공진 오프 특정 매개 변수: 공진 1D를 위한 펄스 프로그램 1HR1rho_HCP_offres1D.es 1HR1r_HH_offres1D.js 공진 오프 실험을 위한 오프셋 CNST30 CNST30 표 2: 1D HCP 기반 및 1D-SELOPE 기반 1H R1θ 실험을 설정하는 매개 변수개요. 약어: 1D = 1차원; HCP = 이종핵 교차 양극화; 셀로페 = 셀렉티브 최적화 양성자 실험; ppm = 백만 개당 부품; HSQC = 이종핵 스핀 양자 상관 관계; SL = 스핀 잠금; RD = 이완 분산 공진 1H R1θ 실험의 설정 및 인수 섹션 3.4에서 실험을 Topspin의 새 폴더에 복사합니다. 이 폴더에서 PL25 및 CNST12를변경할 때마다 서로 다른 SL 강점으로 실험을 설정합니다. 펄스 명령을 사용하여 각 SL 강도에 대한 올바른 전력 레벨을 결정합니다. 1.2~15kHz에 이르는 SL 강점을 사용하며, SL 강도를 낮추기 위한 밀도 높은 샘플링(선택한 SL 강점의 그림 5G 참조). 일부 실험의 복사본을 추가하여 일부 SL 강점에 대한 중복 을 갖습니다. 이러한 실험을 실행합니다. 공진 1H R 1θ 실험 분석 TopSpin에서, 명령 xf2를사용하여 동일한 처리 매개 변수(예를들어, 라인 확대, 위상)를 사용하여 각 의사-2D 데이터 세트의 각 조각을 처리하고, Bruker AU 프로그램 split2D를사용하여 데이터 집합을 1D로 분할한다. 각 1D 슬라이스에 대한 신호 강도 및 볼륨을 가져옵니다.참고 : 실제로, 잠재적으로 겹치는 피크에서 기여를 제거하기 위해 스펙트럼을 deconvolve하는 것이 좋습니다 및 편리하게 텍스트 파일 decall에서 하나의 실험에서 모든 조각의 피크의 강도 또는 영역을 요약 브루커 AU 프로그램 멀티 드콘의 사용을 허용.txt 그런 다음 다른 프로그램으로 쉽게 읽을 수 있습니다 (사내에서 작성된 파이썬 스크립트는 여기에서 사용되었으며, Steiner외. 10에의해 설명된 대로) 3.6.3 및 3.6.4 단계에서. Rθ (또는 공진, R2+REX)값을 얻기 위해 각 SL 강도에 대한 모노 지수 부패를 맞춥니다. 해당 R2+REX 값(y) 대 플롯을 플롯합니다. SL 강도(x)(도 5F,G).참고: 낮은 SL 강도에 대한 값이 상당히 높고 높은 SL 전력(도 5G에도시된 대로)으로 감소하면 조사된 피크가 분산을 나타내며, 흥분상태의인구 및 화학적 변화 차이에 대한 정보를 얻기 위해 추가(off-공명) 실험을 수행하는 것이 재미있을 수 있다. 지상 상태. 4. 1H R1θ 휴식 분산 – 오프 공명 (라벨 1D 버전) 오프 공명 1 H R 1θ실험의 셋업 및 인수 새로운 topspin 폴더에서 특정 SL 강도로 실험을 설정(일반적으로 REX 기여도가 가장 높음으로 가장 낮은 SL 강도에서 먼저, 오프 공명 SL의 대표적인 선택에 대한 그림 5G 참조), 그러나 다른 오프셋, 때마다 CNST30을변경합니다. 도 5H에서볼 수 있듯이 0 오프셋 주위의 밀도 샘플링과 함께 최대 ±(3 또는 4)*SL 강도의 오프셋을사용합니다. 이러한 실험을 실행합니다. 오프 공명 1H R1θ 실험 분석 3.6.1-3.6.3과 동일한 처리 전략을 사용하여 각 오프셋에 대한 Rθ 값을 결정합니다. 해당 값과 오프셋(그림5G)을플롯합니다.참고: 이 곡선의 비대칭은 이미 흥분 상태에 대한 화학 적 변속 정보를 얻을 수 있음을 나타낼 수 있습니다. 블로흐-맥코넬 또는 라게레 방정식을 이용한 철저한 피팅 및 분석은 kEX, pES뿐만 아니라 Δ10, 20(도 5G)에대한 정보를 얻기 위해 수행되어야 한다. 두 1D 실험에 대한 예제 데이터 집합, 펄스 프로그램 및 매크로는 Petzold Lab Github 리포지토리(https://github.com/PetzoldLab)에서 찾을 수 있습니다. 매개 변수에 대한 개요는 표 2에서제공됩니다.

Representative Results

RNA 생산을 위한 프로토콜은 고순도 성적증명서의 생성을 통해 정제를 용이하게 합니다. 도 3A는 탠덤 성적증명서의 여러 분열 반응의 결과를 보여 주며 성공적이고 실패한 반응을 모두 제공한다. 레인 1은 측면 제품의 희미한 흔적만으로 완전히 갈라진 성적 증명서의 최적의 사례를 보여줍니다. 레인 2a는 불완전한 분열을 나타내며, 이는 다시 어닐링하고 더 많은 RNase H(레인 2b, 단계 2.1.2)를 추가하여 해결할 수 있습니다. 차선 1, 2a 및 2b의 RNA 구조는 동일합니다. 레인 3의 샘플은 실패한 분열을 보여줍니다. 이 반응을 해결하는 것은 분열 가이드 순서, DNA 템플릿의 순도 및 온도의 검사를 포함합니다. 잠재적으로, RNase H 분열은 샘플 2에 대해 도시된 바와 같이 T7 IVT 후에 수행되어야 합니다. 레인 4의 샘플은 이온 교환 HPLC를 통해 제거하기 어려운 상당한 양의 분열 측 제품을 나타낸다. 이러한 시료를 트러블슈팅하는 것은 (a) 온도, RNase H의 양 또는 반응 시간, (b) 용출 그라데이션 및 사출 부피를 감소시키고 측 제품으로부터 표적 분획을 분리하려고 시도하는 것을 포함할 수 있다. 이온 교환 HPLC 정제의 해상도를 높이는 방법에 대한 추가 정보는 칼슨 외31에의해 논의되었다. HPLC는 표적 RNA를 더 길거나 더 짧은 핵산 및 단백질 또는 소분자 오염물질로부터 분리합니다. 도 3B는 이온 교환 HPLC 정제에 대한 최적의 결과를 나타낸다. 용출 그라데이션은 표적 RNA 종들이 다음 더 작은 종과 다음 큰 종 앞에 하나의 컬럼 부피(이 예: 35mL) 후에 적어도 하나의 컬럼 부피(이 예: 35mL)를 엘테하는 것을 선택해야 한다. 이 방법의 작은 종은 단일 뉴클레오티드, 중단 성 제품 (8-12 nt), 3′ 및 5 ‘스페이서 서열 (5-14 nt), 및 분열 가이드 (12 nt 키메라 핵산)를 포함하지만, 더 긴 서열은 잠재적으로 항문 반복 및 플라스미드입니다. 잘 분리된 용출 피크가 달성되면, 정화는 주사당 IVT 반응의 ~20mL에 상응하는 것으로 확장될 수 있다. RNA 샘플의 정확한 접지는 RD 실험에 매우 중요하며 모든 측정 전에 확인되어야 합니다. 도 4는 2.4단계(파란색)에서 접이식 프로토콜이 적용되기 전에 A-표지된 22-mer RNA를 나타내며, 올바른 접이식 이후에도 동일한 샘플(red)이 이루어졌다. Mc-Fold 보조 구조예측(도 4C)은제시된 헤어핀 구조를 4개의 베이스 쌍으로 제안하여 5개의 이미노 신호가 생성됩니다. 그림 4A의 두 스펙트럼 모두 약간 다른 상대 강도에도 불구하고 이러한 예측 신호를 확인하며, 이는 일부 잘못 접힌 구조(여기, dimer)가 1H1D 스펙트럼으로만 평가하는 데 문제가 있을 수 있음을 나타냅니다. 방향족 1H,13C-HSQC스펙트럼(도 4B)은접이식 프로토콜(blue) 전에 시료에 대한 방향족 신호 중 3개만 나타내지만, 2.4단계(빨간색)에 따라 접힌 시료에 대한 모든 4개의 신호가 나타난다. 파란색으로 표시된 샘플은 헤어핀과 동일한 imino 신호를 초래할 호모디머(도 4D에서제안된 구조)를 형성할 가능성이 높습니다. A13H2의 신호는 교환 확대 된 것 같습니다. 이러한 결과는 각 RD 실험 전에 imino 및 방향족 지문 실험으로 접는 확인의 중요성을 강조하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜에 설명된 1H R1θ 펄스 서열은 중간 교환 체제에서 역학을 검출할 수 있게 한다. 처음에는 공진 곡선이 기록되고 특정 잔류물에 대한 역학이 존재하는 경우, 이 곡선은 교환없이 잔류물에 대해 평평한 반면, 얻어진 R2+REX 값 내에서 분산이 표시됩니다. 도 5는 합성 RNA 헤어핀(도5A)에서두 개의 상이한 H8 원자에 대해 수득된 대표적인 온공명 곡선을 나타내며, G6H8 체험 교환(도5C),A4H8은 그렇지 않은 반면(도5B). 이샘플(kEX = 292 ± 40Hz)에서 교환속도가 상대적으로 느리기 때문에, 낮은 SL 강도를 달성하기 위한 SELOPE 실험의 장점이 악용되었고, 두 개의 온 공명 곡선은 펄스 서열의 1D 버전을 사용하여 기록되었다. 동일한 펄스 서열은 공진 프로파일에서 분산을 나타내는 잔류물에 대한 공진 데이터를 얻기 위해 사용되었다. 도 5D는 얻어진 R1θ 값 대 오프셋을 나타내며, 여기서 곡선의 약간의 비대칭은 이미 Δω의기호를 나타낸다. R 2 +REX 플롯에서 R1 기여도가 제거됩니다(그림5E). 동일한 그림의 오른쪽 컬럼은 G6H8 경험교환(도 5G)을경험하는 반면, A4H8은(도 5F)를경험하는 반면, 약간 다른 합성 RNA 헤어핀에서 두 개의 다른 H8 원자에 대해 얻은 대표적인 온 공명 곡선을 나타낸다. 빠른환율(kEX = 43,502± 38,478Hz)은 SELOPE 2D 버전을 사용하여 모든 방향족 양성자의 RD 레코딩을 한 번에 허용하여 온-오프 공명 데이터(그림 5H,I에표시됨)를 모두 얻을 수 있었습니다. 양수 및 음수 결과를 위한 일반 식별자탠덤 IVT 및 RNase H 분열의 긍정적인 결과는 다음과 같이 식별될 수 있다: 1) 대상 밴드는 디마링 PAGE 젤에서 가장 강한 밴드이다. 2) 메인 밴드 주위에 더 또는 약한 밴드가 없습니다. 3) 더 또는 약한 더 높은 분자량 종은 없습니다. 4) HPLC 크로마토그램은 표적 RNA의 잘 분리된 피크를 나타낸다. 5) 주 피크를 샘플링하면 단 하나의 밴드만 부인 페이지 젤에 나타납니다. 다음과 같이 탠덤 IVT 및 RNase H 분열의 부정적인 결과는 다음과 같습니다: 1) 아니 또는 단지 약한 메인 밴드는 데니링 PAGE 젤에 볼 수 있습니다. 2) RNA 탠덤 반복에서 높은 분자성 종의 패턴이 눈에 띈다. 3) 메인 밴드가 있지만 유사한 강도의 밴드는 ± 3 nt 내에서 메인 밴드 보다 위 또는 아래에 있습니다. 잘 접힌 시료는 다음과 같이 식별될 수 있다: 1) 관찰된 이미노 양성자의 수는 이차 구조 시뮬레이션에서 예상되는 이미노 양성자의 수와 일치한다(예를들어,Mc-Fold39, 도 4A). 2) UUCG 루프의 G-U 동요 베이스 쌍(존재하는 경우)은 ~9.5 ppm에서 볼 수 있으며 때로는 낮은 온도에서만 볼 수 있습니다. UUCG 루프의 추가 지문은 Fürtig및 동료에 의해 설명되었다(40). 3) 방향족 지문은 올바르게 접는 것으로 확인된 이전에 할당된샘플(도 4C)에동의합니다. 잘못 접히거나 분해된 시료는 다음과 같이 식별될 수 있습니다: 1) 이차 구조 시뮬레이션보다 더 많은 이미노 신호가 예측됩니다(참고: 폐쇄 기본 쌍이 보이지 않는 경우가 많고, 형태 교환이 라인을 넓히기 때문에, 반드시 잘못된 접을 의미하지는 않습니다.). 2) 이미노 신호의 부재. 3) 방향족 영역에서 고강도의 좁은 신호, 단일 뉴클레오티드 분해 생성물을 나타낸다. 4) 확인된 접이식의 기준 샘플에 이미노 또는 방향족 신호 사이의발산(도 4C). 검출 가능한 시간대에 교환을 나타내지 않는 원자는 평면 RD 프로파일로부터 다음과 같이 식별될 수 있다(적용된 SL 전력에 따라 누락된 REX 기여로 인해)(도5B 및 도 5F). 2) kEX및 Δω이 동일한 크기의 경우 느린 중간 교환의 경우주의를 기울여야한다. 이 경우, 공진 기여도 5C에서 볼 수 있는 매우 작을 수 있다(이 경우 장착된 파라미터는 kEX = 292± 40Hz 및 Δω = 112 ± 4Hz)이다. 의심스러운 경우 검증을 위해 낮은 SL 오프 공진 곡선을 기록할 수 있습니다. 중간 시간 척도에서 교환을 나타내는 원자는 공진 RD실험(도 5B 및 도 5F)에서비평평한 이완 분산 프로파일로부터 1)을 식별할 수 있다. 2) HSQC 또는 SELOPE 실험에서 더 넓은 라인폭은 교환의 지표가 될 수 있습니다. 공진 곡선에 대해 잘 선택된 SL 전력값(도 5E,F):1)은 공진 곡선에서 상당한 kEX 기여도를 가지며(선택된 SL 전력 값은 도 5C 및 도 5G로표시됨). 2) 오프 공명 곡선이 적어도 3SL 전력 값으로 측정되기 때문에 선택한 SL 전력 값은 kEX 기여와 함께 공진 곡선의 영역에 분산되어야 합니다. 3) Laguerre 장착 후 비 플랫 R2+ REX 곡선으로 리드(예를 들어, 그림 5D: SL 강점 25, 50, 75 Hz; 그림 5E). 공진 곡선에 대해 잘못 선택된 SL 전력값(그림 5E,F)은Laguerre 장착 후 평평한 R2+ REX 곡선으로 이어집니다. 도 5E에 도 5E에예가 표시되며, 여기서 100Hz 오프 공명 곡선은 매우 평평하므로 Δω에대한 중요한 정보를 제공하지 않습니다. 회전프레임 핵 과로이저 효과(ROE) 아티팩트에 대한 징후: 1) 오프 공명 곡선으로부터 얻은 Δω은 공간 부근/양성자에서 양성자의 화학적 변화와 일치하며, 이는 핵 과다저 효과 분광법(NOESY) 스펙트럼에 대한 관심의 피크와 교차 피크를 보여줍니다. (예를들어, 도 5I는 빠른 중간 교환에 대한 예상대로 광범위한 오프 공명 곡선을 보여 주지만 곡선은 -3000 Hz 및 +1500 Hz에서 와 같은선명한 기능을 가지고 있습니다. 이들은 다른 conformer에서이 H8에 대 한 화학 변화 보다는 ROE 유물 때문에 매우 가능성이 높습니다.) 2) Laguerre 적합은 작동하지만, 잘 작동하지 않습니다 (높은 오류 또는 물리적으로 불가능한 값을 제공) 온 공명및 적어도 3 오프 공명 곡선, 지수가 높은 SINO (>20)와 실험에서 얻은 경우에도(예를 들어, kEX = 43,502 ± 38,478 Hz). 종종 각 SL은 개별적으로 잘 맞지만 함께 피팅하면 훨씬 더 높은 오류가 발생합니다. 반대 동작은 진정한 흥분 상태에 대한 것으로 예상된다. “true” 교환 Δω: 1) 오프 공명 곡선에서 얻은 Δω은 NOESY 스펙트럼에 대한 관심의 피크와 교차 피크를 보여주는 공간 부근/양성자에서 양성자의 화학적 변화와 일치하지 않는다(예: 그림 5E). 2) Laguerre 적합은 공진에 대한 낮은 오류를 제공하고 적어도 3 오프 공명 곡선(예를 들어, 그림 5E 대. 그림 5I, 적합 결과에 대한 캡션 참조). 그림 3: T7 탠덤 IVT 및 RNase H 분열 반응에 의한 샘플 생산. (A)탠덤 IVT 및 RNase H 분열의 긍정적이고 부정적인 결과의 소중 한 페이지. 사다리 높이는 RNA 참조를 지칭하며, 12*는 키메라 골짜기 가이드를 지칭한다. 레인 1: 20nt 표적 RNA의 성공적인 생성. 더 짧고 긴 제품이 거의 없습니다. 레인 2a: 탠덤 성적증명서의 불완전한 분열. HPLC 정화가 가능하지만 많은 물질이 낭비될 것입니다. 레인 2b: 레인 2의 지속적인 RNase H 골짜기는 HPLC 주입에 대비한 깨끗한 샘플을 생성합니다(레인 1과 동일). 레인 4: RNase H 분열은 크게 실패했고, 대상 대역은 생산되지 않았다. 전체 길이 탠덤 성적 증명서는 여전히 600 nt에서 볼 수 있습니다. 레인 5: 대상 밴드가 제작되었지만 강력한 -1 밴드가 존재합니다. HPLC를 수행 할 수 있지만 측면 제품을 신중하게 제거해야합니다. (B)성공적인 HPLC 주입의 예. 38분피크는 표적 길이의 순수 RNA를 포함하고, 더 길고 짧은 제품은 표적 RNA로부터 잘 분리된다. 패널 B가 21에서수정되었습니다. 약어: IVT = 시험관 내 전사; HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피; nt = 뉴클레오티드; AU = 임의 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 4: RNA 헤어핀의 예(파란색) 및 후(빨강) NMR에서 접는 단계 2.4(프로토콜 참조) (A)이미노 영역의 1H-1D 스펙트럼의 A-라벨22-mer RNA. imino 신호의 기본 쌍 ID에 대한 예상 영역은 아래 회색으로 표시됩니다. (B)패널 A로부터 RNA의 방향족 공명의 1H,13C-HSQC 스펙트럼. 접힌 후 샘플(빨간색)은 예상대로 4개의 신호를 나타내고, 접기 전 샘플(파란색)은 3개의 신호만 표시합니다. (C)22-메르 RNA의 맥접기 예측은 헤어핀으로서. 5개의 imino 신호는 패널 A.(D)22-mer RNA에 의해 형성된 호모디머의 두 샘플 모두에서 발견될 수 있는 이 이차 구조로부터 기대되어야 하며, 그 결과 헤어핀 구조와 동일한 5개의 염기 쌍을 초래한다. 약어: NMR = 핵 자기 공명; 1D = 1차원; HSQC = 이종핵 단일 양자 상관관계; ppm = 백만 개당 부품. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5: RNA 헤어핀을 기반으로 두 개의 서로 다른 구문에 대한 1H R1θ RD 대표 결과. (A)왼쪽 컬럼은 불룩한 U 위에 C-G 베이스 쌍을 가진 RNA상에 얻어진 결과를 나타내고, 오른쪽 컬럼은 베이스 쌍이 대신 G-C로 전환된 샘플에서 얻은 결과를 나타낸다. (B)및(F)두 구문에 대해 A4H8에 대해 얻은 평평한 분산 프로파일을 나타내며, 이는 변형 교환이 없음을 나타낸다. (C–E)G-C(G-C) 구조에서 G6에 대해 얻은 공진, 오프 공명 및 장착된 데이터를 표시한다. Laguerre 적합은 다음 결과로 이어진다: R1 = 2.87 ± 0.01 Hz, R2 = 7.76 ± 0.03 Hz, kEX =292 ± 40 Hz, pES = 0.31 ± 0.03 %, Δω = 112 ± 4Hz(G–I)에 공명, 오프-재온( G-z) 및 G6-s에 대한 G6 의 인벤션을 나타낸다. Laguerre 적합은 다음과 같은 결과로 이어진다: R1 = 1.93 ± 0.02 Hz, R2 = 6.71 ± 0.86 Hz, kEX = 43,502 ± 38,478 Hz, pES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. 이 그림은 20에서수정되었습니다. 약어: SL = 스핀 잠금. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

본 명세서에 제시된 프로토콜은 연구기사^{10, 20,}^{21, 31의}형태로 이전에 발표된 여러 프로토콜의 합성이다. 따라서 프로토콜의 세그먼트를 적용할 수 있으며 다른 프로토콜은 판독기의 기본 설정으로 교환할 수 있습니다. 예를 들어, R_1θ 측정은 길이의 접기 및 균일성이 가정된다는 점을 감안할 때 임의의 방법으로 생성된 RNA 샘플에서 수행될 수 있다. 더욱이, 프로토콜은 R 실험에 필요한 RNA 서열계의 공명 할당에 대한 정보를 포함하지 않는다-이는 이전 문헌^19,^37,^38에서광범위하게 다루어졌기 때문이다. 부분, 세그먼트, 또는 사이트별 라벨링^방식(36,^41,^42,^43,^44)은 공진 할당을 용이하게 하거나 RD 실험에 관심이 있는 공진의 중복을 감소시키고 문헌의 길이로 기술된 접근법이다. 이 방법은 이미 공명 할당을 크게 단순화 할 수있는 모든 뉴클레오티드 정체성의 균일 한 라벨링을 사용할 수 있습니다.

여기에 제시된 IVT 메서드는 시퀀스 및 라벨링으로 알려진 문제를 극복하고 수율을 증가시키고 다른 방법에 비해 비용과 작업 시간을 줄입니다. 바이러스 개시 서열의 사용은 반응 최적화의 필요성을 감소시키며, 이는 비-G 개시의 경우 성적증명서의 복사본만 수행하고 산출하는 데 시간이 많이 소요될 수 있는 현장에서 알려진 문제이다. 탠덤 전사체의 T7 IVT 및 RNase H 골짜기는 동일한 용기에서 동시에 수행될 수 있다. 다황 탠덤 반복의 패턴은 RNase H 반응의 완료 시 표적 RNA에 단일 대역에 결합되는 반응 중에 파면 페이지 겔을 볼 수있다(도 3A,차선 1 및 2b). 이 방법을 사용하는 전형적인 수율은 1mL IVT당 30~70nmol RNA 사이의 범위이다. 그러나, 탠덤 반복의 RNase H 분열에 기초한 방법은 그 자체의 특정 문제 없이 오지 않습니다. RNase H 분열 반응은 T7전사(도 3A,레인 2a)와 동시에 주행할 때 완료되지 않는 경우가 많다.

탠덤 유닛의 분리는 전사체에 대한 분열 가이드를 어닐링하고 더 많은 RNaseH(도 3A,레인 2b, 단계 2.1.2)를 추가하여 최종 확정될 수 있다. 대용량의 가열이 느리고 RNA의 Mg²⁺촉매 가수분해로 이어지므로, 종래의 전자레인지가 사용되어 샘플을 10-15s에서 >95°C로 가열하였다. 생산된 견본에 불리한 효력은 지금까지 관찰되지 않았습니다. 일부 구문은 반응 조건의 최적화에 의해 제거될 수 없는 작은 두 번째 대역을보여준다(도 3A,레인 4). 일반적으로 이들은 오히려 HPLC 크로마토그램에서 어깨로 명확하게 볼 수 있으며, 잘 최적화된 용출 그라데이션이 사용되는 경우 제거할 수 있다(단계 2.2.5). 다음 토론은 특히 형태 역학의 해석을 허용하는 고품질 데이터를 얻는 것과 관련하여 프로토콜의 중요한 단계를 강조하는 것을 목표로합니다.

RNase 오염
세포외 RNases는 유비쿼터스, 매우 안정적이며 NMR 샘플의 장기적인 안정성에 가장 큰 위협이됩니다. 따라서 RNase가 없는 환경에서 작업하고 모든 시약 및 플라스틱 제품 RNase를 무료로 유지하는 것이 중요합니다. 필터 팁과 어쩌면 얼굴 마스크의 사용을 권장합니다. 이것은 HPLC 정화 후에 특히 중요합니다. RNases로 오염된 NMR 샘플은 일반적으로 단일 뉴클레오티드 분해 제품으로 인해 며칠 또는 몇 주 후에 ¹H-1D 스펙트럼에서 보이는 좁은 봉우리를 나타낸다. 이러한 샘플은 R _1θ 측정에 적합하지 않습니다.

NMR 샘플
고도로 충전된 특성으로 인해 RNA는 대부분의 단백질과 비교할 때 강수량 없이 고농도로 사용할 수 있습니다. 시게미 NMR 튜브(재료표 참조)의사용은 코일 중앙에 고농축 시료를 중심으로 할 수 있도록 하면서도 감수성 매칭 유리 바닥과 플런저로 인한 이상적인 쉬밍 및 잠금 조건을 제공하기 때문에 유리합니다. 이렇게 하면 B1-불동성이 감소되어 더 좁은 선이 생겨나게 됩니다. NMR 튜브의 일반적인 샘플 부피는 250 μL이며 일반적인 농도는 1-2 mM입니다. 실험이 너무 오래 걸리고 좋은 쉬가 되기 때문에 500 μM 이하의 샘플은 RD 실험에 권장되지 않습니다. 마찬가지로, 200 μL 미만의 샘플 부피는 좋은 심과 필드 안정성(lock)이 필요하기 때문에 권장되지 않습니다. 플런저를 삽입할 때 시료(2.4.5단계)에서 기포의 형성을 피하는 것이 중요합니다. 제대로 고정되지 않으면 플런저가 샘플로 아래로 미끄러져 감지 가능한 볼륨을 줄일 수 있습니다. 더욱이, 온도의 급격한 변화는 견본에 있는 새로운 기포의 형성으로 이끌어 낼 수 있습니다. 따라서 샘플을 운반할 때와 NMR 분광계에서 프로브 온도를 변경할 때주의를 기울여야 합니다. 더 긴 기간 후에 다시 측정할 때 시료를 거품에 대해 확인합니다.

RNA 접이식
동적 RNA 분자는 제대로 접히지 않을 때 여러 적합성에 존재할 수 있습니다. 이차 구조물의 용융 온도는 실온보다 약간 높을 수 있지만 측정 전에 철저한 가열 및 스냅 냉각 절차를 권장합니다. 운동 제어(가열 및 스냅 냉각)에서 접이식 고농축 헤어핀 샘플은 시간이 지남에 따라 호모이머를 형성할 수 있으며, 이는 각 NMR 측정 전에 RNA 접이식의 엄격한 제어가 필요합니다. 측정된 RNA가 헤어핀 구조가 아니라 RNA 이중인 경우 열역학 제어 하에 느린 접이식이 적용되어야 합니다.

이 경우 가열 후 냉각 공정은 시간 범위에 있어야 하며 RNA는 NMR 샘플의 최종 부피 및 농도에서 사용되어야 합니다. 예상 이미노 및 방향족 공명의 초기 수는 샘플의 균질성에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 샘플이 예상된 것처럼 보이지 않으면 다시 접혀야 합니다. Mg²⁺ (염화물 염으로 추가) 접는 RNA 구조에 도움이 될 수 있습니다^(45. 실제로 접이식 제어는 적어도 부분적으로 NMR 공진을 할당하고 실험적으로 이차 구조를 해결하는 데 사용된 샘플에 대한 비교 역할을 한다.

스핀 잠금 전원 및 난방 고려 사항
^1H R_1θ RD 실험을 2D 개요 실험으로 실행하는 경우 SL 전력은 1.2kHz 미만이어야 합니다. 무선 주파수 송신기 주파수는 관심피크의 ppm 영역 의 중간에 배치되어야한다(예를 들어,방향족 양성자의 경우 7.5 ppm). 그런 다음 1.2 kHz의 대역폭은 주요 공진 효과없이 이러한 양성자를 스핀 잠금시킬 만큼 충분히 큽것입니다. 이러한 효과는 RD 프로파일에서 식별할 수 있습니다. 이러한 문제가 발생하면 R₂+R_EX 값이 증가하는 대신 SL 전력 값이 증가하며 특히 낮은 SL 전력의 경우 증가합니다. 계산된 SL 전력 값이 샘플에 전달된 전력과 일치하는지 확인합니다. 실제로, 1 ^H90° 하드 펄스가 새로운 분광계에서 신중하게 보정된 경우 계산된 SL 전력을 사용할 수 있습니다. 그러나 원하는 각 대역폭에 대해 SL 전력을 보정하여 이를 확인할 수 있습니다.

^1H R_1θ RD 실험에서 사용할 수 있는 SL 전력의 범위는 매우 광범위하여 다양한 시료 가열(HCP 기반 시퀀스에 대한 HSQC의 경우 1.2kHz ~ 15kHz, SELOPE 실험을 위한 50Hz ~ 15kHz)로 이어집니다. 저전력 SLs에대해 얻은 1D를 비교할 때 화학적 시동이 약간 변화함에 따라 불평등한 시료 가열을 감지할 수 있다. 고출력 SLs. 이 효과는 일반적으로 이종핵에 대한 R_1θ 실험에서 열 보정에서 고려되지 않습니다. 이러한 실험의 열 보정은 일반적으로 각 스핀 잠금 전원 시리즈의 vd 목록에 지정된 다양한 스핀 잠금 지속 시간으로 인해 다른 가열을 보정하도록 설정되어 있습니다. 특히 SELOPE 실험의^{경우, 20에}설명된 바와 같이 적용된 모든 SL 강도에 대해 두 번째 열 보정을 사용해야 한다.

vd 목록 고려 사항
앞에서 언급했듯이, vd 목록은 강도의 상당한 붕괴를 얻을 수 있을 만큼 긴 시간점을 포함해야 합니다(이상적으로 초기 신호의 30%까지 또는 프로브의 사양 내에서 70% 부패에 도달할 수 없는 경우 가능한 한 낮음). vd 목록은 낮은 SL 전력(1.2kHz)에 최적화되었지만 이 vd 목록은 사용할 가장 높은 SL전력(예:15kHz)에서 테스트해야 합니다. 이는 R_EX 기여도가 높은 봉우리들의 경우 높은 SL 전력에서 부패가 훨씬 느려질 것이라는 사실 때문입니다. 따라서 높은 SL 전력에서도 충분한 부패를 검증해야 합니다. 공진 이 외에도 높은 오프셋에서 부패를 고려해야 합니다. vd 목록의 이상적인 최대 시간점은 분산 실험의 다른 영역에 대해 크게 다를 수 있습니다. 이 경우 vd 목록에 더 많은 포인트가 포함될 수 있으며, 분석 중에 더 높은 SL 전력 또는 더 높은 오프셋에 대한 더 긴 VD 목록 포인트는 낮은 SINO에 따라 폐기될 수 있습니다. 일반적으로 5-8 vd 목록 포인트는 J-커플링과 같은 비지수수하 부패로 이어지는 잠재적 인 유물을 발견 할 수 있는 것으로 간주되어야합니다(아래 참조).

1D–HCP 선택성 고려 사항
2D HSQC 기반 실험의 ^1H치수에 대한 관심피크와 또 다른 피크가 겹치는 경우 HCP 기반 1D 버전을 실행할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. HCP 기반 전송은 매우, 하지만 결코 100% 선택적, 따라서 그것은 또 다른 피크 1D에 관심의 피크의 강도와 부패 행동에 기여 발생할 수 있습니다. 이에 대한 표시는 레이블이 붙은 실험의 1D 및 2D 버전을 사용하여 얻은 공진 R_1θ 값의 차이일 것입니다.

ROE 고려 사항:
느린 중간 교환을 가진 원자의 오프 공명 곡선의 경우, ROE 유물은 NOESY 또는 ROESY 스펙트럼과 얻은 Δω의 비교에 기초하여 식별 될 수있다. Δω에해당하는 화학 적 시프트 차이로 교차 피크를 식별 할 수 있다면, 관찰 된 흥분 상태는 실제로 ROE 아티팩트일 수 있습니다(예를 들어,ROE는 방향족 양성자 사이에 발견되었으며, 이는 모두 동일한 화학 적 변화 범위에 있으므로 공진^{곡선(20)에}의해 덮여 있다. 경험에서, 이것은 항상 큰 오류와 가난한 적합을 주도, 아마도 때문에 ROE는 증가하는 SL 전력R _EX와 같은 패턴을 따르지. 중간 빠른 교환이 상황은 더욱 어려워집니다. 온 공명 곡선은 GS와 ES 간의 교환 공정을 대표하는 (이웃 핵에서 얻은 ¹³C 데이터와 비교하여) 여전히 여러 ROE 유물의 영향을 받습니다.

이 경우, 교환 공정을 감지하는 SL 전력은 > 더 크므로 다양한 ROE 후보의 화학적 변화 차이에 걸쳐 공진 곡선으로 더 많은 수의 양성자를 가로지르며(H8의 경우 ca. ±1000Hz, H5/H1의 ca. -1200Hz, imino protons)에서 의아컬한 양성자입니다. 지금까지, 이러한 ROE 유물을 억제하는 방법이 발견되지 않았으며(부분적으로 유족 뉴클레오티드(46)를 사용하는 것 이외에), 공진 데이터는 빠른 중간 교환을 위해 기록되어서는 안 되며, 실제 Δω에 대한 신뢰할 수 있는 정보는 이 방법으로 추출될 수 없기 때문에 NOE/ROE 기여도는 NOESY 스펙트럼을 통해 배제될 수 없다.

J-커플링(하트만-한) 고려 사항
H6과 같은 호모핵 J-커플 양성자에 대한 공진 곡선은^10,^20을성공적으로 기록했지만, 특히 하트만-한 매칭 조건이 조사된 오프셋의 넓은 범위에 걸쳐 있을 수 있기 때문에 낮은 SL 전력에 대해 공진 측정을 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다. Hartmann-Hahn 유물은 공진 RD 플롯^20에서SL 강도를 증가시켜 지수 붕괴 또는 R₂+R_EX 값을 증가시 진동으로 식별할 수 있다.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 T7 RNA 폴리머라제와 대장균 RNase H, 마틴 Hällberg의 발현 및 정제에 대한 카롤린스카 연구소의 단백질 과학 시설 (PSF)에 감사, 그리고 귀중한 토론을위한 전체 Petzoldlab. 우리는 매크로와 피팅 스크립트에 대한 기여에 대한 U-벌지 구조와 에밀리 스타이너와 캐롤라이나 폰타나의 준비루카 레타티노 감사합니다. 우리는 카롤린스카 연구소와 의료 생화학 및 생물 물리학학과가 600 MHz 분광기 및 위치 파이낸싱 (KI FoAss 및 KID 2-3707/2013)의 구매 지원을 지원한 것을 인정합니다. 베텐스코프로데트(#2014-4303), 스티프텔슨 포르스크닝(ICA14-0023, FFL15-0178), 라그나르 쇠데르베르크 스티펠스(M91-14), 하랄드 오크 그레타 청바지 의 재정적 기여에 감사드립니다. (JS20140009), 칼 트리거스티스 스티펠스 (CTS14-383 및 15-383), 에바 오크 오스카 아렌스티펠스, 오케 위버그 스티펠스 (467080968 및 M14-0109), 암폰덴 (CAN 2015/388), J.S. 마리 Skłodowska-Curie IF를 통해 자금을 인정 (EU H2020, MSCA-IF 프로젝트 no. 747446).

Materials

40% Acrylamide/Bis Solution	Bio-Rad	161-0144
5-alpha Competent E. coli	NEB	C2987I
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	49199
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
AFC-3000, HPLC Fraction collector	Thermo Scientific	5702.1
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414
Amersham ImageQuant 800 UV	GE Healthcare	29399482	Replacing LAS-4000 or equivalent
Amicon ultra centrifugal filter unit	Sigma-Aldrich	UFC900324
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
ATP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645702
BamHI restriction enzyme	NEB	R0136L
Bottle top filter	VWR	514-1019
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	1081220005
Cleavage guide	IDT	N/A	or equivalent
CTP	Sigma-Aldrich	C1506
CTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645699
D2O	Sigma-Aldrich	151882
Dionex Ultimate 3000 UHPLC system	Thermo Scientific	N/A
DL-Dithiotreitol	Sigma-Aldrich	43815
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
DNAPac PA200 22×250 Semi-Prep column	Thermo Scientific	SP6734
DNAPac PA200 22×50 guard column	Thermo Scientific	SP6731
E.coli RNase H	NEB	M0297L	or made in-house uniprot ref. P0A7Y4
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44	Eppendorf	5804R
Ethanol 95%	Fisher scientific	11574139
Ethanol 95% denatured	VWR	85829.29
Formamide	Sigma-Aldrich	47671
GelRed	VWR	41003
GeneRuler 1kbp Plus	Fisher Scientific	SM1333	Optional
GMP	Sigma-Aldrich	G8377
GMP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	650684
GTP	Sigma-Aldrich	G8877
GTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645680
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H1758
Inorganic pyrophosphatase	Sigma-Aldrich	I1643-100UN	or made in-house uniprot ref. P0A7A9
Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer	Sigma-Aldrich	T4415
Julabo TW8 Water bath	VWR	461-3117
kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis	VWR	700-0056	or comparable
LB broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB broth with agar (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
Low Range ssRNA Ladder	NEB	N0364S	Optional
LPG-3400RS Pump	Thermo Scientific	5040.0036
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	63068
microRNA Marker	NEB	N2102S
Microwave oven	Samsung	MS23F301EAW
Mini-PROTEAN electrophoresis equipment	Bio-Rad	1658004
NucleoBond Xtra Maxi	Machinery-Nagel	740414.10M
pUC19 plasmid containing tandem insert	Genscript	N/A	or equivalent
RNaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020
Shigemi tube 5mm	Sigma-Aldrich	Z529427
Single-use syringe, Luer lock tip	VWR	613-2008
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	730-1470
Sodium perchlorate	Sigma-Aldrich	71853
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S3139
Spermidine trihydrochloride	Sigma-Aldrich	85578
SYBR Gold	ThermoFisher	S11494
Syringe filters	VWR	514-0061
T7 RNA polymerase	Sigma-Aldrich	10881767001	or made in-house uniprot ref. P00573
TCC-3000RS Column thermostat	Thermo Scientific	5730
Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Fisher Scientific	10103203
UMP	Sigma-Aldrich	U6375
UMP-13C9/15N2	Sigma-Aldrich	651370
Urea	Sigma-Aldrich	U5378
UTP	Sigma-Aldrich	U6625
UTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645672
VWD-3100 Detector	Thermo Scientific	5074.0005

Referencias

Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
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Feyrer, H., Schlagnitweit, J., Petzold, K. Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of ¹H R_1ρ Relaxation Dispersion Experiments of RNA. J. Vis. Exp. (173), e62470, doi:10.3791/62470 (2021).