Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Hannes Feyrer; Judith Schlagnitweit; Katja Petzold

doi:10.3791/62470

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioquímica

Praktische aspecten van monstervoorbereiding en -opstelling van ¹H R_1ρ ontspanningsdispersie-experimenten met RNA

Published: July 09, 2021

doi:

10.3791/62470

Hannes Feyrer¹, Judith Schlagnitweit¹, Katja Petzold¹

¹Department of Medical Biochemistry and Biophysics,Karolinska Institutet

Summary

We presenteren een protocol om micro- tot millisecondedynamiek te meten op ¹³^C/15N-gelabeld en ongelabeld RNA met ¹H R_1ρ ontspanningsdispersie nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie. De focus van dit protocol ligt op het hoogzuiver voorbereiden en opzetten van NMR-experimenten.

Abstract

RNA is een zeer flexibel biomolecule, waarbij veranderingen in structuren cruciale rollen spelen in de functies die RNA-moleculen uitvoeren als cellulaire boodschappers en modulatoren. Hoewel deze dynamische toestanden verborgen blijven voor de meeste structurele methoden, maakt R_1ρ ontspanningsdispersie (RD) spectroscopie het mogelijk om de conformatiedynamiek in het micro- tot milliseconderegime bij atoomresolutie te bestuderen. Het gebruik van ¹H als waargenomen kern breidt het behandelde tijdsregime verder uit en geeft directe toegang tot waterstofbindingen en basiskoppeling.

De uitdagende stappen in een dergelijke studie zijn hoogzuiver en hoogproductief monsterpreparaat, mogelijk ¹³C- en ¹⁵N-gelabeld, evenals het opzetten van experimenten en het aanpassen van gegevens om populatie, wisselkoers en secundaire structuur van de voorheen onzichtbare toestand te extraheren. Dit protocol biedt cruciale praktische stappen in de monstervoorbereiding om de voorbereiding van een geschikt RNA-monster en de installatie van 1 H R_{1ρ-experimenten} met zowel isotopisch gelabelde als niet-gelabelde RNA-monsters te garanderen.

Introduction

RNA ‘s vervullen een veelheid aan regulerende¹, katalytische²en structurele³ functies in de cel , waarvan vele gecorreleerd zijn met een flexibele moleculaire structuur en ingewikkelde veranderingen van die structuren⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Laagbevolkte toestanden blijven onzichtbaar voor de meeste methoden van structuurbepaling of staan de studie van deze verborgen toestanden bij hoge atoomresolutie niet toe. Solution-state nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopie combineert beide aspecten door toegang te bieden tot individuele atoomkernen en biedt een grote toolbox van experimenten gericht op dynamiek door alle tijdregimes⁸. RD NMR-experimenten bieden toegang tot conformationele uitwisseling in de tussenliggende tijdschaal , waarbij veranderingen in basiskoppelingspatronen en lokale structurele herschikkingen kunnen worden verwacht⁵^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴. RD-experimenten worden uitgevoerd als lange R_2-metingen in de vorm van een Carr-Purcell-Meiboom-Gill-pulstrein¹⁵ of als ontspanningsmetingen in het roterende frame, R_1ρ RD-experimenten¹⁶genoemd.

Hoewel beide kunnen worden gebruikt om populatie- en wisselkoers- en chemische verschuivingsverschil naar de kleine toestand te extraheren, geven R_1ρ RD-experimenten ook het teken van het chemische verschuivingsverschil van de opgewekte toestand. Dit maakt een gevolgtrekking op secundaire structuur mogelijk, die sterk correleert met chemische verschuiving in RNA-structuren¹⁷. De chemische verschuiving is een goede indicator van helicity in het geval van aromatische protonen en koolstof op de nucleobases, van basiskoppelpartners voor imino-protonen en van suikerbobbels op de C4′ en C1′-atomen¹⁸^,¹⁹. Opgemerkt moet worden dat onlangs een experiment met chemische uitwisselingsverzadigingsoverdracht (CEST) met een hoger spin lock (SL)-vermogen, waardoor de toepasbaarheid van het CEST-experiment werd verschoven naar snellere uitwisselingstijdschalen, werd gepubliceerd als alternatief voor het R_1ρ RD-experiment voor systemen met één opgewonden toestand.

Hoewel ¹³C – en ¹⁵N-isotopen vaak zijn gebruikt om toegang te krijgen tot structurele uitwisseling , werd recent werk uit dit laboratorium aromatische en imino-protonen gebruikt als sondes voor conformationele uitwisseling⁹^,¹⁰. Het gebruik van ¹H als waargenomen kern brengt verschillende voordelen met zich mee, bijvoorbeeld toegang tot uitwisseling op snellere en langzamere tijdschalen, hogere gevoeligheid en kortere meettijden. Dit wordt verder vergemakkelijkt door de SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE) benadering, die toegang biedt tot aromatische protonen door decrowding van het eendimensionale (1D) spectrum met behulp van homonucleaire scalaire koppelingen, in plaats van een heteronucleaire magnetisatieoverdracht, en het elimineren van de noodzaak voor isotooplabels²⁰. Dit protocol heeft betrekking op de meting in ¹H R_1ρ RD-experimenten van uniform ¹³C/15 N-gelabelde en niet-gelabelde monsters. Daarom presenteert dit artikel een monstervoorbereidingsmethode die het meest veelzijdig bleek te zijn voor verschillende monstervoorbereidingsbehoeften²¹ en bespreekt alternatieven in de laatste sectie van dit artikel (figuur 1).

Op dit punt moet de lezer er rekening mee houden dat andere monstervoorbereidingstechnieken aanvaardbaar zijn voor ^experimentenmet 1 H R_1ρ RD en dat andere methoden voor structurele en functionele analyse kunnen worden uitgevoerd met de monsters die met de gepresenteerde techniek zijn gesynthetiseerd. ¹ H R_1ρ RD-experimenten vereisen hoge RNA-concentraties (idealiter >1 mM) en een hoge homogeniteit, zowel in RNA-lengte als structurele conformatie om een betrouwbare karakterisering van de moleculaire dynamica te garanderen. In vitro transcriptie (IVT) is de methode bij uitstek voor veel onderzoekers om ¹³C/¹⁵N-gelabelde RNA-monsters te produceren vanwege de beschikbaarheid van gelabelde nucleosidetrifosfaten (NTPs) en facile-opname in de enzymatische reactie²². De veel gebruikte T7 RNA-polymerase (T7RNAP)^{23 , 24}^,²⁵ lijdt echter aan een lage homogeniteit van 5′ in het geval van bepaalde initiatiesequenties²⁶^,²⁷ en vaak ook 3′ homogeniteit tijdens transcriptieafvloeiing²⁸. Zuivering van de doel-RNA-soorten wordt duurder en bewerkelijker vanwege de behoefte aan grote hoeveelheden ~ 200 nmol. De hier gebruikte methode is eerder gepresenteerd , waarbij de voordelen in het algemeen werden besproken²¹. Kortom, het lost beschreven problemen op door een groter tandemtranscript te transcriberen dat vervolgens site-specifiek wordt gespleten door Escherichia coli RNase H, geleid door een chimerisch oligonucleotide²⁹^,³⁰ (zie figuur 2 voor meer informatie).

De opname van een afstandsvolgorde aan de uiteinden van 5′ en 3′ van het tandemtranscript maakt het gebruik van een initiatiesequentie met hoge opbrengst en verwijdering van terminaloverhangen in de buurt van de linearisatieplaats van de plasmidesjabloon mogelijk (figuur 2B). De methode bleek de opbrengsten aanzienlijk te verbeteren, terwijl de kosten en arbeid werden verminderd, met het voorbehoud van een complexere sjabloonsynthese en de behoefte aan een extra enzym en oligonucleotide. De hoge specificiteit van RNase H-decolleté vergemakkelijkt de zuivering vanwege het gebrek aan RNA-soorten in een vergelijkbaar groottebereik. Het huidige protocol maakt gebruik van een ionenuitwisseling high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) stap die onlangs door dit laboratorium is gepubliceerd³¹, hoewel andere methoden mogelijke alternatieven zijn. ¹ H R_1ρ RD kan in het algemeen worden verkregen op gelabelde of niet-gelabelde monsters met twee respectieve pulssequenties, het “gelabelde” ¹H R_1ρ heteronucleaire single quantum correlation (HSQC)-gebaseerd experiment met een ¹³C indirecte dimensie¹⁰ en het “ongelabelde“ ¹H R_1ρ SELOPE-gebaseerd experiment met een ¹H indirecte dimensie²⁰.

Deze tweedimensionale (2D) experimenten kunnen dienen als eerste controle, ongeacht of dynamiek op de R_1ρ tijdschaal aanwezig is in het monster. Een overzicht van RD voor alle opgeloste pieken in de spectra kan worden verkregen en pieken van belang voor een grondigere RD-analyse kunnen worden geïdentificeerd. Dit betekent dat zelfs niet-gelabelde monsters kunnen worden gecontroleerd voordat een beslissing wordt genomen om een duurder, gelabeld monster te produceren. Zodra een piek met conformationele uitwisselingsbijdrage is geselecteerd om grondiger te worden bestudeerd, is het het beste om over te schakelen naar de 1D-versies van de bovenstaande experimenten (als de piek nog steeds kan worden opgelost) om zogenaamde off-resonance-experimenten uit te voeren. Voor de gelabelde versie wordt de HSQC-overdracht naar ¹³C vervangen door een selectieve heteronucleaire crosspolarisatie (HCP) stap zoals gebruikt in ¹³C R_1ρ experimenten³²^,³³^,³⁴^,³⁵, terwijl in het geval van het SELOPE-experiment het experiment gewoon als een 1D wordt uitgevoerd, wat vooral handig is voor H8- en H2-signalen die toch op de diagonaal in de 2D liggen. Een criterium voor de te gebruiken volgorde, op voorwaarde dat zowel een gelabeld als een niet-gelabeld monster beschikbaar is, is hoe goed de piek van belang in de twee experimenten is geïsoleerd.

Over het algemeen wordt het SELOPE-experiment aanbevolen voor RNA-monsters van maximaal 50 nucleotiden. Voor grotere RNA’s zal de overlap groter zijn; structureel interessante nucleotiden komen echter vaak voor in chemische verschuivingsgebieden die minder overlappend zijn en nog steeds toegankelijk kunnen zijn in nog grotere RNA’s. Een ander argument zou zijn dat in niet-gelabelde monsters geen J-koppeling plaatsvindt tussen ¹H en ¹²C. Aangezien het minimale spinslotvermogen echter wordt gedefinieerd door het minimumvermogen dat wordt gebruikt om deze twee spins (~ 1 kHz) in het gelabelde experiment te ontkoppelen, maakt het niet-gelabelde experiment het gebruik van een breder scala aan SL-sterktes (Spin Lock) mogelijk en dus toegang tot een bredere tijdschaal van uitwisseling. Deze off-resonantie experimenten bieden aanvullende informatie aan k_ex, zoals populatie van de opgewekte toestand (alternatieve conformer), p_ES, evenals zeer waardevolle chemische verschuivingsinformatie in de vorm van Δω (het chemische verschuivingsverschil van de grondtoestand en de opgewekte toestand).

Figuur 1: Workflow van het gepresenteerde protocol. Voorbereiding vóór de daadwerkelijke grootschalige monsterproductie, bestaande uit sjabloonvoorbereiding en bevestiging van succesvolle in vitro transcriptie en RNase H-decolleté. Grootschalige productie inclusief HPLC-zuivering, vullen van NMR-buis en bevestiging van RNA-vouwen. In het geval van isotoopgelabelde synthese moet een niet-gelabelde zuivering worden uitgevoerd voor gradiëntoptimalisatie op dezelfde dag. NMR karakterisering van conformationele dynamica met R_1ρ experimenten. Elke stap kan onafhankelijk worden uitgevoerd, bijv.de 1 H R ^1ρRD-analyse kan worden toegepast op elk geschikt RNA-monster dat met een andere methode wordt geproduceerd. Afkortingen: IVT = in vitro transcriptie; HPLC = hoogwaardige vloeistofchromatografie; NMR = nucleaire magnetische resonantie; RD = ontspanningsdispersie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Het doel van dit protocol is om praktische details en kritische parameters te bieden voor de studie van conformatiedynamiek met ¹H R_1ρ ontspanningsdispersie in RNA-haarspeldmoleculen. Na het verstrekken van een gedetailleerd protocol van de ontwerp-, synthese- en ionenuitwisseling HPLC-zuivering van een doel-RNA die kan worden uitgevoerd met behulp van alle, sommige of geen NTPs als ¹³C/¹⁵N-gelabelde versies, is de workflow beschreven van het afronden van het NMR-monster en het bevestigen van de conformationele uitwisseling met NMR-spectroscopie. Ten slotte worden de details beschreven voor de opstelling van ¹H R_1ρ RD-experimenten op een Bruker NMR-spectrometer (figuur 1). Het protocol geeft elke stap om de 1D-versie in te stellen voor gelabelde voorbeelden en aanvullende opmerkingen en een tabel om aan te passen voor het instellen van de SELOPE-versie (Tabel 2). Na het protocol worden kritische stappen en alternatieve routes voor monstervoorbereiding en ¹H R_1ρ RD setup besproken.

Protocol

Figuur 2: Schematische weergave van het gerapporteerde tandem IVT-protocol. (A) Tandemtranscriptie van een ge lineariseerde plasmidesjabloon met T7RNAP (links) en opeenvolgende decolleté door RNAse H van het transcript om doellengte RNA te bereiken, geleid door een chimerische DNA-gids (rechts). (B) Gedetailleerd schema van de tandemsjabloon beginnend met de virale T7RNAP-promotor, een initiatiesequentie. De doelvolgorde (donkerblauw, voorbeeld hier is 20 nt lang) wordt “n” keer herhaald. De herhalingen worden geflankeerd door een afstandssequentie van 5′ en 3′, bestaande uit respectievelijk de laatste acht en de eerste vier nucleotiden, om de initiatie- en beperkingssequenties van de eerste en laatste herhalingseenheid te kunnen verwijderen. (C) Hybridisatie van het tandemtranscript (rood) en de chimerische decolletégeleiders (groen). RNase H splijt het RNA tegenover het DNA 5′ uiteinde. De 2′-OMe RNA flanken verhogen de specificiteit door de bindingsaffiniteit van de decolletégids voor het doel-RNA te verbeteren. Dit cijfer is gewijzigd van 21. Afkortingen: T7RNAP = T7 RNA polymerase. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 1. Voorbereiden van werkzaamheden voor een nieuwe RNA-constructie Plasmid ontwerp en voorbereiding Schrijf de sjabloonvolgorde in een kloontool, bijvoorbeeldSerial Cloner. Neem de T7 promotorsequentie en voeg een initiatiesequentie met hoge opbrengst toe (T7: 5′-TAATACGACTCACTATA ^GGGAGA-3′).OPMERKING: Transcriptie begint bij de nucleotide aangegeven met een caret (^). De initiatiesequentie GGGAGA is variabel, maar sterk sequentieafhankelijk; daarom wordt het gebruik van deze volgorde aanbevolen. Voeg de laatste 8 nucleotiden (nt) van de doelvolgorde toe als een afstandsbewoy van 5′ (5’S). Voeg herhalingen van de doelvolgorde (TS) toe. Voeg de eerste vier nucleotiden toe als een afstandsbalk van 3′ na de herhalingen (5’S). Voeg een BamHI-beperkingssite (RS) of een vergelijkbare unieke beperkingssite toe.OPMERKING: De totale volgorde zoals weergegeven zal worden gekloond of gemakkelijk worden besteld in een bacteriële high-copy plasmide(bijv.pUC19): 5′-T7-5’S-(TS)n-3’S-RS-3′ (Figuur 2B). Het aantal herhalingen moet zo hoog zijn als toegestaan door gensynthese (maximaal 600 nt in dit protocol). Versterk de plasmide in E. coli met behulp van een commerciële kit. Lineariseer de gezuiverde plasmide bij 20 ng/μL met behulp van de juiste beperkingsplaats. Schaalbeperking verteert met BamHI met maximaal 1 ml. Zuiver de verteerde plasmide en bevestig succesvolle linearisatie op een 1% agarosegel. Bewaar de geseraliseerde plasmide bij -20 °C gedurende enkele maanden. Decolleté gids ontwerp (Figuur 2C) Schrijf de laatste acht nucleotiden van de doel-RNA-sequentie in de 5′-3′-richting en voeg de eerste vier nucleotiden van de doel-RNA-sequentie toe aan het 3′-uiteinde, ook in de 5′-3′-richting. Genereer het omgekeerde DNA-complement van die reeks Verander de eerste en laatste vier nucleotiden in hun 2′-OMe modificaties door een ‘m’ toe te voegen voor de nucleotide letter.OPMERKING: Voor synthese wordt mU gebruikt in plaats van mT. Bestel het oligo met standaard ontsaltingszuivering.OPMERKING: Controleer of het gegenereerde oligo zich op een andere plaats kan binden dan de verbinding van twee RNA-sequenties. Volledige complementariteit in de centrale vier DNA-nucleotiden is vereist, terwijl de flankerende regio’s een mismatch mogelijk kunnen maken. Breid indien nodig de flanken uit tot maximaal 18 nt om een unieke bindingssequentie te genereren36. Kleinschalig IVTOPMERKING: Bereid voor RNase-vrij werk alle reagentia onder steriele en RNase-vrije omstandigheden. Gebruik RNase decontaminatiereagens (zie de materialentabel)en 95% v/v ethanol om werkoppervlakken en pipetten voor gebruik te reinigen. Was handschoenen met 95% ethanol en draag pluisvrije kleding met lange mouwen. Om RNase-verontreiniging te minimaliseren, mag u niet over open buizen ademen. Bereid voorraadoplossingen voor van Tris-Cl (pH 8,0), dithiothreitol, MgCl2,spermidine en NTPs/GMP (niet-gebufferd). Meng reagentia zoals weergegeven in tabel 1. Bereid van tevoren een hoofdmix van deze reagentia voor, voordat enzymen of nucleïnezuren worden toevoeging.OPMERKING: Als u bevroren reagentia gebruikt, meng ze dan grondig na het ontdooien. Reagentia kunnen neerslaan als ze in te hoge concentraties worden gemengd, dus het wordt ten zeerste aanbevolen om de volgorde in tabel 1te volgen . Voeg in de volgende volgorde toe: plasmide, decolletégeleider, anorganische fosfatase (IPPase), RNase H, T7RNAP. Aangezien de enzymactiviteit kan variëren voor enzymen die in eigen huis worden geproduceerd, test u verschillende concentraties voordat u de beste selecteert.OPMERKING: Voeg een negatieve controle toe voor de decolletéreactie, bijvoorbeeld zonder RNase H, om een ontbrekende doelband toe te schrijven aan een gebrekkig RNase H-decolleté en niet aan mislukte transcriptie. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 1 uur en bevestig de reactie op een denaturering polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) (Figuur 3A). Verdun het monster 10-voudig in de laadoplossing en laad 1 μL op de gel.OPMERKING: Gelmengsel: 8 M ureum, 20% acrylamide (19:1 acrylamide:bisacrylamide) in 1x TBE. Laadoplossing: 5 mM ethyleeniaminetetraazijnzuur (EDTA), 300 μM bromoffenolblauw in formamide. RNase H decolletéreacties kunnen niet worden verwacht na 1 uur, omdat er constant nieuw RNA wordt geproduceerd. Kijk op dit punt uit naar een duidelijke doelband en de afwezigheid van een soort met een vergelijkbaar molecuulgewicht(bijv.±3 nucleotide (nt) producten). Reagens Voorraadconcentratie Hoeveelheid kleinschalig (μL) H2O – 24 Tris 1 M 5 MgCl2 1 M 0.5 DTT 1 M 0.5 Spermidine 250 mM 5 GMP 100 mM 2.5 ATP 100 mM 1.5 GTP 100 mM 1.5 UTP 100 mM 1.5 CTP 100 mM 1.5 Plasmide 20 ng/μL 5 Decolleté gids 100 μM 10 iPPase 10 mg/ml 0.5 RNase H 10 μg/ml 2 T7 RNA polymerase 5 mg/ml 2 Tabel 1: Reagenstabel voor tandem IVT en gelijktijdig RNase H decolleté. Voorraadconcentraties kunnen worden aangepast aan het gemakvande gebruiker. Als RNase H-decolleté moet worden uitgevoerd na T7 IVT, voeg dan decolletégeleider en RNase H toe na hitte-inactivatie van T7RNAP. Gebruikte hoeveelheden schalen lineair met reactieschaal. Afkortingen: T7RNAP = T7 RNA polymerase; IVT = in vitro transcriptie. 2. NMR-monstervoorbereiding Schaal de reactie op het gewenste volume (meestal 10 ml) op en voer de reactie ‘s nachts uit. Test op reactieafronding de volgende dag met een denaturering PAGE gel (Figuur 3A).OPMERKING: Onvolledige decolletéreactie wordt aangetoond door soorten met een hoger molecuulgewicht boven de doelband. Als het decolleté niet succesvol of compleet was, reanneal RNA en de decolletégeleider in het reactievat door de oplossing in een conventionele magnetron te verwarmen op 450 W gedurende 15 s. Koel de oplossing gedurende 40 minuten langzaam af tot 37 °C. Gebruik een verwarmingsblok voor volumes van minder dan 1 ml. Let op de vorming van nieuw neerslag. Voeg meer IPPase en RNase H toe en incubeer nog eens 1-3 uur bij 37 °C. Bevestig de voltooiing van de decolletéreactie met denaturering PAGE. Wanneer de RNase H-decolletéreactie is voltooid, dooft u de reactie door EDTA toe te voegen aan de eindconcentratie van 50 mM en vortex grondig.OPMERKING: Potentiële pyrofosfaatprecipitatie lost op en er vormen zich nieuwe eiwitprecipitaten. Filtreer de oplossing door een spuitfilter van 0,2 μm en concentreer u op een volume dat in een HPLC-systeem kan worden geïnjecteerd, afhankelijk van de grootte van de injectielus.OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken door het monster bij -20 °C in te vriezen. Grootschalige HPLC-zuivering Bereid ionenuitwisselingsbuffers A en B binnen een week na gebruik voor. Filter en ontgas de buffers.OPMERKING: Buffer A: 20 mM natriumacetaat; 20 mM natriumperchloraat, pH 6,5. Buffer B: 20 mM natriumacetaat; 600 mM natriumperchloraat, pH 6,5. Equilibreert de kolom met 100% buffer B gevolgd door 100% buffer A voor ten minste 2 kolomvolumes bij 75 °C. Bereid de HPLC-reeks (figuur 3B) voor met een debiet van 5,5 ml/min. Gebruik de volgende volgorde voor de zuivering van een RNA-formaat tussen 20 en 30 nt: 0-7 min: 0% B; 7-16 min: gradiënt 0-20% B; 16-46 min: elutie, meestal met een gradiënt van 20-30% B (optimaliseren volgens behoeften); 46-62 min: 100% B; 62-73 min: 0% B.OPMERKING: Een verandering in het debiet van 5,5 naar 8 ml/min had geen invloed op de scheiding in dit protocol. Optimaliseer de elutiegradiënt door een equivalent van 1 ml transcriptiereactie (niet gelabeld) per keer in te injectie.OPMERKING: Voor meer details en discussie, zie Karlsson et al.31 en Feyrer et al.21. Test de verzamelde fracties op een denatureringsPAGINA. Als de belangrijkste elutiepiek goed geïsoleerd is en het zuivere doel-RNA bevat, schaalt u de zuivering op tot een equivalent van 10 ml transcriptiereactie. Verzamel de fracties van rente, concentreer je en wissel de buffer uit met NMR-buffer. Gebruik een ultracentrifugaalfiltereenheid (zie de materialentabel)voor volumes boven 50 ml.OPMERKING: NMR-buffer: 15 mM natriumfosfaat; 25 mM natriumchloride; 0,1 mM EDTA, pH 6,5. Om het verlies van RNA aan plastic buiswanden te minimaliseren, wast u alle opvangbuizen met 1 ml water, vortex en centrifuge om alle vloeistof te verzamelen. Bepaal de concentratie via ultraviolette spectroscopie. Bereken de reactieopbrengst volgens Feyrer et al21.OPMERKING: De concentratie van een NMR-monster voor RD-experimenten mag niet lager zijn dan 130 nmol, wat overeenkomt met 500 μM in een monstervolume van 250 μL met NMR-buizen (Tabel van materialen). Vouwen van een RNA-monster Verdun en aliquot het monster van een volume van ~10 ml in 1 ml per buis. Verwarm de RNA aliquots gedurende 5 min tot 95 °C. Koel de monsters af door ze op ijs of in een water-ijs-zoutmengsel te plaatsen en incubeer gedurende 30 minuten. Poolmonsters en concentraat tot ~250 μL in een centrifugaalfiltereenheid van 2 ml. Vullen van een NMR buis Reinig de NMR-buis in de NMR-buisreiniger door opnieuw te spoelen met overvloedig water, RNase-ontsmettingsreagens, water, 95% ethanol (EtOH) en water. Laat drogen. Reinig de zuiger door te spoelen met water en af te vegen met RNase ontsmettingsreagens en 95% EtOH met een pluisvrij doekje. Laat drogen. Voeg 10% (v/v) D2O toe aan het NMR-monster. Vul het RNA-monster in de NMR-buis met behulp van een grote pipetpunt. Laat de vloeistof langs de zijkant van de buiswand stromen. Plaats de zuiger en verwijder luchtbellen door de zuiger samen met een snelle draaibeweging naar beneden te duwen. Trek de zuiger langzaam omhoog zonder nieuwe luchtbellen te creëren en bevestig deze met paraffinewasfilm. Bevestig het vouwen door NMR.OPMERKING: Op dit punt is het noodzakelijk om ten minste gedeeltelijke resonantietoewijzing uit te voeren om de secundaire structuur van het RNA-monster te bevestigen en om gebieden te identificeren die van belang zijn voor de studie van de conformatiedynamiek. Een uitputtende beschrijving van RNA-resonantietoewijzing zou dit protocol overschrijden , daarom verwijzen we naar gevestigde literatuur op dit punt19,37,38. Een elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest (EMSA) kan een nuttige indicator zijn voor het vouwen van RNA en dienen als aanvullende gegevens voor NMR-experimenten. Vergelijk de volgende spectra van het monster waarvoor 1H R1ρ RD-experimenten worden uitgevoerd met het correct gevouwen referentiemonster (figuur 4): 1H 1D, met name het iminogebied 10–15 ppm; Aromatisch 1H,13C-HSQC; 1 H,1H-SELOPE (optioneel).OPMERKING: Een aromatische vingerafdruk is ook nodig, zelfs in het geval van overeenstemming tussen imino-signalen, omdat dimervorming vaak dezelfde of vergelijkbare iminosignalen vertoont als een RNA-haarspeld. Het SELOPE-experiment kan een 1H,13C-HSQC vervangen voor aromatische vingerafdrukken, omdat heteronucleaire experimenten op niet-gelabelde monsters erg tijdrovend zijn. Gebruik de UUCG-lus als vingerafdrukreferentie (indien aanwezig). Voer deze vergelijking elke keer uit voordat 1H R1ρ RD-experimenten worden geregistreerd. 3. 1H R1ρ Ontspanningsdispersie—on-resonantie (gelabelde 1D-versie) OPMERKING: De onderstaande stappen beschrijven de installatie van RD-experimenten voor een gelabeld monster met behulp van de 1D-versie van de op HSQC gebaseerde RD-pulssequentie. Volg dezelfde stappen voor de op SELOPE gebaseerde 1D-reeks voor niet-gelabelde monsters. Een overzicht van parameternamen en -instellingen voor beide gevallen wordt weergegeven in tabel 2. De focus op 1D-versies is omdat ze praktischer zijn voor off-resonantiemetingen, en de opstelling van de 2D-versies van de op SELOPE en HSQC gebaseerde experimenten zijn in detail besproken door respectievelijk Schlagnitweit et al.20 en Steiner et al.10. Bepaal 1H vermogen voor een harde 90° puls (P1). Optie A: Gebruik bruker pulsecal commando. Optie B: Bepaal in een zg-experiment de 360° puls door een noteringscurve te meten op het protonhardpulsvermogensniveau op de waterpiek.OPMERKING: De 90° pulslengte is een vierde van de duur waarin nulsignaal wordt waargenomen (als een volledige noteringscurve wordt gemeten, dan is het de tweede nul; in de praktijk wordt echter alleen het gebied rond de verwachte waarde voor de 360° bemonsterd). Voer een 1H 1D spectrum zgesgp.f2f3dec uit met behulp van de pulslengte bepaald in stap 3.1 om het RNA vouwen voor elke R1ρ meting te bevestigen.OPMERKING: Als 1H SL-experimenten voor de eerste keer worden uitgevoerd, controleer dan of het berekende SL-vermogen overeenkomt met het vermogen dat aan het monster wordt geleverd door het SL-vermogen voor elke gewenste bandbreedte te kalibreren. Gedetailleerde kalibratiestappen worden beschreven in Steiner et al.10. Maak een 1H R1ρ voor gelabelde gegevensset en stel belangrijke parameters in. Een nieuwe gegevensset maken; idealiter gebaseerd op een 1H-13C aromatische HSQC-dataset zoals gebruikt op volledig gelabelde RNA-monsters voor RNA-toewijzing.OPMERKING: Dit zorgt ervoor dat er al 13C en 15N vermogen en ontkoppelingsvermogen zijn ingesteld. Stel de algemene parameters in volgens het eerste deel van tabel 2. Stel RD-specifieke parameters in volgens het tweede deel van tabel 2. Stel 1H SL-vermogen in op de laagste waarde (1,2 kHz) voor testen. Genereer een test-vd-lijst met slechts één vermelding, 0 ms, (om de vd-lijst te optimaliseren, zoals beschreven in stap 3.4), stel TDF1 in op 1 en werk D30bij . Voer een testspectrum uit met deze instellingen. Optimaliseer de vd-lijst (lijst met sl-lengtes die moeten worden gebruikt). Voer het experiment uit met een vd-testlijst (bijv.zes vermeldingen: 0 m, 5 m, 10 m, 20 m, 30 m, 40 m; vervorm deze waarden om systematische fouten als gevolg van verwarming te voorkomen). Werk D30 en TDF1 dienovereenkomstig bij (in dit voorbeeld D30 = 42m en TDF1 = 6). Plotintensiteit van de piek versus SL-lengte. Identificeer de SL-lengte waarbij de intensiteit van de oorspronkelijke piek afneemt tot 1/3. Maak de definitieve vd-lijst die in het experiment moet worden gebruikt, rekening houdend met het volgende: bepaal de langste SL-lengte zoals beschreven in de vorige stap; vermijd het gebruik van een lijst met afnemende of stijgende volgorde; en voeg enkele duplicaten toe voor statistische studies. Vergeet niet om D30 en TDF1 bij te werken telkens wanneer er wijzigingen zijn in de vd-lijst.OPMERKING: Het experiment wordt uitgevoerd met verschillende SL-lengtes zoals aangegeven in de vd-lijst op een pseudo-2D-manier. Selecteer het aantal scans zodat de zwakste piek van de lijst een signaal-ruisverhouding (SINO) van ten minste 10 heeft.OPMERKING: Hoewel de vd-lijst is geoptimaliseerd voor een laag SL-vermogen (1,2 kHz), moet deze vd-lijst ook worden getest met het hoogste SL-vermogen dat moet worden gebruikt(bijv.15 kHz). Dit komt omdat het verval veel langzamer zal zijn bij een hoog SL-vermogen voor pieken met een aanzienlijke kEX-bijdrage. Daarom moet een voldoende verval ook worden geverifieerd bij een hoog SL-vermogen. Beschrijving van parameter Parameternaam in pulssequentie 1D gelabeld 1D ANTILOPE pulsprogramma voor on-resonantie 1Ds 1HR1rho_HCP_onres1D.es 1HR1r_HH_onres1D.js 1 H-dragerfrequenties (ppm) O1P = waterresonantie in ppm O1P = chemische verschuiving van piek van belang (ppm) CNST28 = chemische verschuiving van piek van belang (ppm) CNST29 = waterresonantie in ppm 1 H harde 90º puls P1 @ PL1 (zoals gekalibreerd in 3.1.1) P1 @ PL1 (zoals gekalibreerd in 3.1.1) Gevormde pulsen en krachten voor wateronderdrukking P25 = 1000 ons @ sp3 P12 = 2000 ons @ sp1 (Waterpoort) (excitatie beeldhouwen) 13 C drager frequentie, on-resonantie met 13C chemische verschuiving van piek van belang O2P – 15 N dragerfrequentie, gemiddelde 15N chemische verschuiving voor ontkoppeling (zoals gebruikt in aromatische HSQC) O3P – 13 C/15N ontkoppeling (ingesteld als in HSQC) pcpd2, cpd2 – pcpd3, cpd3 HCP-overdracht (bijv. p=1/J bij 100 Hz) – pulse en pulsef2 commando’s kunnen worden gebruikt om krachten van harde pulsen te bepalen Duur (ingesteld op 1/J(1H-13C) van piek van belang) P11 Vermogen 1H en vermogen op 13C SP1, SP12 SELOPE-overdracht (d = 1/4J(H5-H6)) – D5 Selectieve puls (bijv. aromatisch gebied) voor SELOPE (4000 us, Eburp) – P13 en SP4 SL / RD-specifieke parameters: 1 H SL-vermogen, verkregen uit gekalibreerde harde puls (bijv. met behulp van de pulsopdracht). Pl25 en CNST12 (1,2 – 15 kHz) Pl24 (50 Hz – 15 kHz) Variabele vertragingslijst voor SL-duur (aanvankelijk 1 vermelding, 0, optimalisatie beschreven onder 3.1.3) vdlist (~ 0 – 40 ms) vdlist (~ 0 – 150 ms vanwege de lage R2 in niet-gelabelde monsters) TDF1 aantal vermeldingen in de vd-lijst (aanvankelijk 1) TDF1 TDF1 Warmtecompensatie: D30 = grootste waarde in vd-lijst + 2 ms D30 D30 Extra warmtecompensatie voor zeer breed scala aan SLs PL25 Off-resonantie specifieke parameters: pulsprogramma voor off-resonantie 1Ds 1HR1rho_HCP_offres1D.es 1HR1r_HH_offres1D.js Offset voor off-resonantie experimenten CNST30 CNST30 Tabel 2: Overzicht van parameters voor het opzetten van 1D HCP-gebaseerde en 1D-SELOPE-gebaseerde 1H R1ρ experimenten. Afkortingen: 1D = eendimensionaal; HCP = heteronucleaire kruispolarisatie; SELOPE = SELective Geoptimaliseerd Proton Experiment; ppm = delen per miljoen; HSQC= heteronucleaire spin kwantumcorrelatie; SL = spinslot; RD = ontspanningsdispersie Opzetten en verwerven van on-resonantie 1H R1ρ experimenten Kopieer het experiment van sectie 3.4 naar een nieuwe map in Topspin. Stel in deze map experimenten in op verschillende SL-sterktes, telkens met pl25 en CNST12. Bepaal het juiste vermogensniveau voor elke SL-sterkte met behulp van de pulsopdracht. Gebruik SL-sterktes variërend van 1,2 tot 15 kHz, met een dichtere bemonstering voor lagere SL-sterktes (zie figuur 5G voor geselecteerde SL-sterktes). Voeg kopieën van sommige experimenten toe om duplicaten te hebben voor sommige SL-sterktes. Voer deze experimenten uit. Analyse van on-resonantie 1H R1ρ experimenten Verwerk in TopSpin elk segment van elke pseudo-2D-gegevensset met dezelfde verwerkingsparameters(bijv. lijnverbreding, fase) met behulp van de opdracht xf2en splits de gegevensset in 1D’s met behulp van het Bruker AU-programma split2D. Verkrijg signaalintensiteiten en volumes voor elk 1D-segment.OPMERKING: In de praktijk is het beter om de spectra te deconvolveren om bijdragen van mogelijk overlappende pieken te verwijderen en het gebruik van het Bruker AU-programma multidconmogelijk te maken, dat handig de intensiteiten of gebieden van de pieken van alle segmenten samenvat in één experiment in het tekstbestand decall.txt, dat vervolgens gemakkelijk kan worden uitgelezen met andere programma’s (Python-scripts die hier in eigen huis zijn geschreven, zoals beschreven door Steiner et al.10) in stappen 3.6.3. Plaats een mono exponentieel verval voor elke SL-sterkte om de R1ρ (of on-resonantie, R2+REX) waarde te verkrijgen. Plot die R2+REX-waarden (y) vs. SL-sterkte (x) (Figuur 5F,G).OPMERKING: Als de waarden aanzienlijk hoger zijn voor lage SL-sterktes en afnemen met een hoger SL-vermogen (zoals weergegeven in figuur 5G),dan toont de onderzochte piek dispersie, en het kan interessant zijn om aanvullende (off-resonantie) experimenten uit te voeren om informatie te verkrijgen over de populatie en het chemische verschuivingsverschil van de opgewekte toestand versus. de grondtoestand. 4. 1H R1ρ Ontspanningsdispersie—off-resonantie (gelabelde 1D-versie) Opzetten en verkrijgen van off-resonance 1H R1ρ experimenten Stel in een nieuwe topspinmap experimenten in op een bepaalde SL-sterkte (meestal eerst bij de laagste SL-sterkte omdat de REX-bijdrage daar het hoogst is, zie figuur 5G voor een representatieve selectie van off-resonantie-SLs), maar met verschillende offsets, waarbij cnst30telkens wordt gewijzigd. Gebruik offsets tot ± (3 of 4)*SL-sterkte, met een dichtere bemonstering rond 0 offset, zoals te zien is in figuur 5H, I. Voer deze experimenten uit. Analyse van off-resonantie 1H R1ρ experimenten Gebruik dezelfde verwerkingsstrategie als in 3.6.1–3.6.3 om een R1ρ-waarde voor elke offset te bepalen. Plot deze waarden versus offset (Figuur 5G).OPMERKING: Een asymmetrie in deze curve kan er al op wijzen dat chemische verschuivingsinformatie voor de opgewekte toestand kan worden verkregen. Grondige montage en analyse met behulp van Bloch-McConnell- of Laguerre-vergelijkingen moeten worden uitgevoerd om informatie te verkrijgen over kEX, pES en Δω10,20 ( figuur5G). Voorbeeldgegevenssets, pulsprogramma’s en macro’s voor beide 1D-experimenten zijn te vinden in de Petzold Lab Github-opslagplaats (https://github.com/PetzoldLab). Tabel 2geeft een overzicht van de parameters .

Representative Results

Het protocol voor RNA-productie vergemakkelijkt zuivering door het genereren van hoogzuivere transcripties. Figuur 3A toont de resultaten van verschillende decolletéreacties van tandemtranscripties, die zowel succesvolle als onsuccesvolle reacties opleveren. Lane 1 toont het optimale geval van een volledig gespleten transcriptie met slechts vage sporen van nevenproducten. Baan 2a vertoont onvolledig decolleté, dat kan worden opgelost door opnieuw te gloeien en de toevoeging van meer RNase H (Lane 2b, stap 2.1.2). De RNA-constructies van de rijstroken 1, 2a en 2b zijn hetzelfde. Het monster in baan 3 toont een onsuccesvol decolleté. Het oplossen van deze reactie zou een controle van de splitsingsgeleidingssequentie, zuiverheid van DNA-sjabloon en gloeitemperaturen omvatten. Mogelijk moet RNase H-decolleté worden uitgevoerd na T7 IVT, zoals getoond voor monster 2. Het monster in baan 4 toont een aanzienlijke hoeveelheid decolletézijdeproducten, die moeilijk te verwijderen zijn via ionenuitwisseling HPLC. Het oplossen van problemen met een dergelijk monster kan bestaan uit (a) het verlagen van de temperatuur, de hoeveelheid RNase H of de reactietijd, (b) het verminderen van elutiegradiënt en injectievolume en het proberen de doelfracties van de nevenproducten te scheiden. Karlsson c.s.31hebben meer informatie verstrekt over de vraag hoe de resolutie in de HPLC-zuivering van ionenuitwisseling kan worden verhoogd. HPLC scheidt het doel-RNA van langere of kortere nucleïnezuren en eiwit- of kleinmolecuulverontreinigingen. Figuur 3B toont het optimale resultaat voor de ionenuitwisseling HPLC zuivering. De elutiegradiënt moet zodanig worden gekozen dat de doel-RNA-soort ten minste één kolomvolume (in dit voorbeeld: 35 ml) na de volgende kleinere soort en één kolomvolume vóór de volgende grotere soort eluteert. Kleinere soorten in deze methode omvatten enkele nucleotiden, abortieve producten (8-12 nt), 3′ en 5′ spacer sequenties (5-14 nt), en decolleté gids (12 nt chimeric nucleic acid), terwijl langere sequenties zijn potentieel onreine tandem herhalingen en de plasmide. Wanneer een goed gescheiden elutiepiek wordt bereikt, kan de zuivering worden opgeschaald tot het equivalent van ~ 20 ml IVT-reactie per injectie. De juiste vouw van een RNA-monster is cruciaal voor RD-experimenten en moet vóór elke meting worden bevestigd. Figuur 4 toont een A-gelabeld 22-mer RNA voordat het vouwprotocol in stap 2.4 (blauw) werd toegepast en hetzelfde monster nadat het juiste vouwen is bereikt (rood). Een Mc-Fold secundaire structuurvoorspelling (Figuur 4C) stelt de gepresenteerde haarspeldstructuur voor met 4 basisparen wat resulteert in 5 iminosignalen. Beide spectra in figuur 4A bevestigen deze voorspelde signalen, zij het met iets verschillende relatieve intensiteiten, wat aangeeft dat een verkeerd gevouwen structuur (hier een dimer) problematisch kan zijn om te beoordelen met slechts 1H 1D-spectra. Een aromatisch 1H,13C-HSQC spectrum (Figuur 4B), toont echter slechts 3 van de aromatische signalen voor het monster vóór het vouwprotocol (blauw), maar alle 4 signalen voor het monster dat is gevouwen volgens stap 2.4 (rood). Het in blauw getoonde monster vormde waarschijnlijk een homodimeer (structuur voorgesteld in figuur 4D)dat zou resulteren in dezelfde iminosignalen als de haarspeld. Het signaal van A13H2 lijkt exchange-verbreed. Deze resultaten helpen om het belang van vouwbevestiging te benadrukken met zowel imino- als aromatische vingerafdrukexperimenten vóór elk RD-experiment. De 1H R1ρ pulssequenties beschreven in dit protocol maken de detectie van dynamiek in het tussenliggende uitwisselingsregime mogelijk. In eerste instantie wordt een onresonantiecurve geregistreerd en als er dynamiek aanwezig is voor een specifiek residu, is een dispersie zichtbaar binnen de verkregen R2+REX-waarden, terwijl deze curve vlak is voor residuen zonder uitwisseling. Figuur 5 toont representatieve on-resonantiecurven verkregen voor twee verschillende H8-atomen in een synthetische RNA-haarspeld (figuur 5A), waarin G6H8 ervaringen uitwisselen (figuur 5C), terwijl A4H8 dat niet doet (Figuur 5B). Aangezien de uitwisseling in dit monster relatief traag is(kEX = 292 ± 40 Hz), werd het voordeel van het SELOPE-experiment om lage SL-sterktes te bereiken benut en werden de twee onresonantiecurven geregistreerd met behulp van de 1D-versie van de pulssequentie. Dezelfde pulssequentie werd vervolgens gebruikt om off-resonantiegegevens te verkrijgen voor het residu dat dispersie in het on-resonantieprofiel aantoont. Figuur 5D toont de verkregen R1ρ-waarden versus offset, waarbij een lichte asymmetrie van de curve al het teken van Δωaangeeft . Dit wordt nog duidelijker in het R2+REX-perceel waar de R1-bijdrage wordt verwijderd ( figuur5E). De rechterkolom van dezelfde figuur toont representatieve on-resonantiecurven verkregen voor twee verschillende H8-atomen in een iets andere synthetische RNA-haarspeld met snellere uitwisseling, waarbij G6H8 ervaringen uitwisselt (Figuur 5G), terwijl A4H8 dat niet doet (Figuur 5F). De snellere wisselkoers (kEX = 43.502 ± 38.478 Hz) maakte het mogelijk om alle aromatische protonen tegelijk te registreren met behulp van de SELOPE 2D-versie om zowel on- als off-resonantiegegevens te verkrijgen (G6H8-gegevens weergegeven in figuur 5H,I). Algemene identificatiegegevens voor positieve en negatieve resultatenPositieve resultaten in de tandem IVT en RNase H decolleté kunnen als volgt worden geïdentificeerd: 1) De doelband is de sterkste band in de denaturering PAGE gel. 2) Er zijn geen of slechts zwakke banden rond de hoofdband. 3) Er zijn geen of slechts zwakke soorten met een hoger molecuulgewicht. 4) Het HPLC-chromatogram toont een goed gescheiden piek van het doel-RNA. 5) Wanneer de hoofdpiek wordt bemonsterd, verschijnt er slechts één band op een denatureringsPAGINA-gel. Negatieve resultaten in de tandem IVT en RNase H decolleté aanwezig als volgt: 1) Geen of alleen een zwakke hoofdband is zichtbaar op een denatureren PAGE gel. 2) Een patroon van soorten met een hoog molecuulgewicht van RNA tandem repeats is zichtbaar. 3) Hoewel de hoofdband aanwezig is, bevinden banden van vergelijkbare intensiteit zich binnen ± 3 nt boven of onder de hoofdband. Een goed gevouwen monster kan als volgt worden geïdentificeerd: 1) Het aantal waargenomen iminoprotonen komt overeen met het aantal iminoprotonen dat wordt verwacht van een secundaire structuursimulatie(bijv.Mc-Fold39, figuur 4A). 2) Het syn G-U wiebelbasispaar in een UUCG-lus (indien aanwezig) is zichtbaar bij ~9,5 ppm, soms alleen zichtbaar bij lagere temperatuur. Verdere vingerafdrukken van de UUCG-lus zijn beschreven door Fürtig en collega’s40. 3) De aromatische vingerafdruk komt overeen met een eerder toegewezen monster dat correct is gevouwen (figuur 4C). Een verkeerd gevouwen of gedegradeerd monster kan als volgt worden geïdentificeerd: 1) Er zijn meer iminosignalen dan een secundaire structuursimulatie voorspelt (OPMERKING: minder iminosignalen impliceren niet noodzakelijkerwijs een verkeerde plooiing, omdat het sluiten van basisparen vaak niet zichtbaar is en de conformationele uitwisseling lijnen verbreedt). 2) Afwezigheid van imino signalen. 3) Smalle signalen van hoge intensiteit in het aromatische gebied, wat wijst op enkelvoudige nucleotidegradatieproducten. 4) Divergentie tussen imino- of aromatische signalen en een referentiemonster van bevestigd vouwen (figuur 4C). Een atoom dat geen uitwisseling in de detecteerbare tijdschaal vertoont, kan als volgt worden geïdentificeerd: 1) uit een vlak RD-profiel (vanwege de ontbrekende REX-bijdrage die varieert met het toegepaste SL-vermogen) (figuur 5B en figuur 5F). 2) Er moet rekening worden gehouden met het geval van langzame tussentijdse uitwisseling wanneer kEX en Δω van dezelfde grootte zijn. In dat geval kan de bijdrage aan de resonantie zeer klein zijn, zoals te zien is in figuur 5C (in dit geval zijn de gemonteerde parameters kEX = 292 ± 40 Hz en Δω = 112 ± 4 Hz). Bij twijfel kan een lage SL off-resonantiecurve ter verificatie worden geregistreerd. Een atoom dat uitwisseling in de tussenliggende tijdschaal vertoont, kan worden geïdentificeerd 1) aan de dee den 1) uit een niet-vlak ontspanningsdispersieprofiel in een RD-experiment met onresonantie(figuur 5B en figuur 5F); 2) een bredere lijnbreedte in het HSQC- of SELOPE-experiment kan ook een indicator zijn voor uitwisseling. Goed geselecteerde SL-vermogenswaarden voor off-resonantiecurven(figuur 5E, F): 1) hebben een aanzienlijke k EX-bijdrage in de on-resonantiecurve (geselecteerde SL-vermogenswaarden zijn aangegeven in figuur 5C en figuur 5G). 2) Aangezien off-resonantiecurven worden gemeten voor ten minste 3 SL-vermogenswaarden, moeten de geselecteerde SL-vermogenswaarden worden verdeeld over het gebied van de onresonantiecurve met kEX-bijdrage. 3) Leiden tot niet-vlakke R2+REX-curven na de Laguerre-pasvorm (bijv. , Figuur 5D: SL-sterktes 25, 50 en 75 Hz; Figuur 5E). Slecht geselecteerde SL-vermogenswaarden voor off-resonantiecurven(figuur 5E, F) leiden tot vlakke R2+REX-curven na de Laguerre-pasvorm. Een voorbeeld is weergegeven in figuur 5E, waarin de 100 Hz off-resonance curve zeer vlak is en daarom geen significante informatie over Δω geeft. Indicaties voor roterende frame nucleaire Overhauser effect (ROE) artefacten: 1) Δω verkregen uit off resonantie curven komen overeen met chemische verschuivingen van protonen in ruimtelijke omgeving / protonen, die een kruispiek vertonen met de piek van interesse in het nucleaire Overhauser effect spectroscopie (NOESY) spectrum. (bijvoorbeeld, figuur 5I toont brede off-resonantiecurven zoals verwacht voor snelle tussenliggende uitwisseling, maar de curven hebben ook scherpere kenmerken, bijvoorbeeldbij -3000 Hz en +1500 Hz. Deze zijn zeer waarschijnlijk te wijten aan een ROE artefact in plaats van een chemische verschuiving voor deze H8 in een andere conformer). 2) Laguerre fit werkt wel, maar werkt niet goed (geeft hoge fouten of fysiek onmogelijke waarden) voor een on-resonantie en ten minste 3 off-resonantie curven, hoewel exponentiëlen werden verkregen uit experimenten met hoge SINO (>20) (bijv. kEX = 43.502 ± 38.478 Hz). Vaak past elke SL individueel goed, maar het in elkaar passen geeft een veel hogere fout; het tegenovergestelde gedrag wordt verwacht voor een echte opgewonden toestand. Indicaties voor “echte” uitwisseling Δω: 1) Δω verkregen uit off-resonantiecurven komen niet overeen met chemische verschuivingen van protonen in ruimtelijke omgeving/protonen, die een kruispiek vertonen met de piek van belang in het NOESY-spectrum (bijv. figuur 5E). 2) Laguerre fit geeft lage fouten voor een on-resonantie en ten minste 3 off-resonantie curven(bijv. figuur 5E vs. Figuur 5I, zie bijschrift voor de resultaten van de pasvorm). Figuur 3: Monsterproductie door T7 tandem IVT en RNase H decolletéreactie. (A) Denaturering PAGINA van positieve en negatieve resultaten van tandem IVT en RNase H decolleté. Ladderhoogte verwijst naar RNA-verwijzingen, 12* verwijst naar de chimerische decolletégeleider. Lane 1: Succesvolle generatie van een 20 nt doel RNA. Er zijn weinig kortere en langere producten aanwezig. Baan 2a: Onvolledig decolleté van het tandem transcript. Hoewel HPLC-zuivering mogelijk is, zou er veel materiaal worden verspild. Lane 2b: Voortdurend rnase H decolleté van Lane 2 produceert een schoon monster klaar voor HPLC injectie (identiek aan Lane 1). Baan 4: RNase H decolleté was grotendeels niet succesvol, en er werd geen doelband geproduceerd. Het tandemtranscript over de volledige lengte is nog steeds zichtbaar op 600 nt. Lane 5: Er werd een doelband geproduceerd, maar er is een sterke -1 band aanwezig. Hoewel HPLC kan worden uitgevoerd, is een zorgvuldige verwijdering van het zijproduct noodzakelijk. (B) Voorbeeld van een succesvolle HPLC injectie. De piek van 38 min bevat zuiver RNA van de streeflengte, terwijl langere en kortere producten goed gescheiden zijn van de doel-RNA. Paneel B is gewijzigd van 21. Afkortingen: IVT = in vitro transcriptie; HPLC = hoogwaardige vloeistofchromatografie; nt = nucleotiden; AU = willekeurige eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4: Voorbeeld van een RNA haarspeld voor (blauw) en na (rood) de vouwstap 2.4 (zie protocol) in NMR. (A) Imino gebied van een 1H-1D spectrum van een A-gelabeld 22-mer RNA. Verwachte regio’s voor de identiteit van het basispaar van imino-signalen worden hieronder in grijs weergegeven. (B) 1H,13C-HSQC spectrum van de aromatische resonanties van het RNA uit paneel A. Het monster na het vouwen (rood) toont 4 signalen zoals verwacht, terwijl het monster voor het vouwen (blauw) slechts 3 signalen weergeeft. (C) Mc-Fold voorspelling van de 22-mer RNA als haarspeld. Van deze secundaire structuur zijn vijf iminosignalen te verwachten, die in beide monsters in paneel A te vinden zijn. (D) Voorgestelde structuur van een homodimeer gevormd door het 22-mer RNA, resulterend in dezelfde 5 basisparen als de haarspeldstructuur. Afkortingen: NMR = nucleaire magnetische resonantie; 1D = eendimensionaal; HSQC = heteronucleaire enkelvoudige kwantumcorrelatie; ppm = delen per miljoen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur. 5: 1H R1ρ RD representatieve resultaten voor twee verschillende constructies op basis van een RNA haarspeld. (A) De linkerkolom toont de resultaten die op de RNA zijn verkregen met een C-G-basispaar boven de uitgepuilde U, terwijl de rechterkolom resultaten toont die zijn verkregen op een monster waarbij het basispaar in plaats daarvan op G-C is geschakeld. (B) en (F) tonen vlakke dispersieprofielen zoals verkregen voor A4H8 voor de twee constructies, wat wijst op geen conformatie-uitwisseling. (C–E) tonen on-resonantie, off-resonantie en gemonteerde gegevens verkregen voor G6 in de (G-C) constructie. De Laguerre-pasvorm leidt tot het volgende resultaat: R1 = 2,87 ± 0,01 Hz, R2 = 7,76 ± 0,03 Hz, kEX =292 ± 40 Hz, pES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) tonen op resonantie, off-, resonantie en fitted gegevens. De Laguerre fit leidt tot het volgende resultaat: R1 = 1,93 ± 0,02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, k EX = 43.502 ± 38.478 Hz, p ES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Dit cijfer is gewijzigd van 20. Afkorting: SL = spin lock. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Het hierin gepresenteerde protocol is een synthese van verschillende protocollen die eerder zijn gepubliceerd in de vorm van onderzoeksartikelen¹⁰^,²⁰^,²¹^,³¹. Daarom kunnen segmenten van het protocol worden toegepast, terwijl andere kunnen worden uitgewisseld naar de voorkeur van de lezer. De R _1ρ-metingen kunnen bijvoorbeeld worden uitgevoerd op een RNA-monster dat met elke methode is geproduceerd, aangezien wordt uitgegaan van vouwen en homogeniteit van de lengte. Bovendien bevat het protocol geen informatie over resonantietoewijzing van de RNA-sequentie-een stap die vereist is voor RD-experimenten – aangezien dit uitgebreid is behandeld in eerdere literatuur¹⁹^,³⁷^,³⁸. Gedeeltelijke, segmentale of sitespecifieke etiketteringsschema’s³⁶^,^41,⁴²^,⁴³^,⁴⁴ zijn benaderingen om resonantietoewijzing te vergemakkelijken of de overlapping van resonanties te verminderen die van belang zijn voor RD-experimenten en die uitvoerig in de literatuur zijn beschreven. Deze methode maakt het gebruik van uniforme etikettering van elke nucleotide-identiteit mogelijk, wat resonantietoewijzing al aanzienlijk kan vereenvoudigen.

De hier gepresenteerde IVT-methode overwint bekende problemen met sequenties en etikettering, verhoogt de opbrengst en verlaagt de kosten en werktijd in vergelijking met andere methoden. Het gebruik van de virale initiatiesequentie vermindert de behoefte aan reactieoptimalisatie, wat een bekend probleem in het veld is dat tijdrovend kan zijn om uit te voeren en slechts enkele kopieën van het transcript oplevert in het geval van niet-G-initiatie. Het T7 IVT- en RNase H-decolleté van het tandemtranscript kan tegelijkertijd in hetzelfde vat worden uitgevoerd. Een patroon van multimerische tandemherhalingen is te zien op een denaturering PAGE gel tijdens de reactie, die samensmelt tot een enkele band op de doel-RNA na voltooiing van de RNase H-reactie(figuur 3A,rijstroken 1 en 2b). Typische opbrengsten met deze methode variëren tussen 30 en 70 nmol RNA per 1 ml IVT. Toch komt de methode op basis van RNase H-decolleté van tandemherhalingen niet zonder bepaalde problemen op zich. De RNase H-decolletéreactie gaat vaak niet naar voltooiing wanneer deze gelijktijdig met T7-transcriptie wordt uitgevoerd(figuur 3A,baan 2a).

De scheiding van tandemeenheden kan worden voltooid door de decolletégeleider in het transcript te gloeien en meer RNase H toe te voegen(figuur 3A,baan 2b, stap 2.1.2). Omdat de verwarming van grote volumes traag is en leidt tot Mg²⁺-gekatalyseerde hydrolyse van RNA, werd een conventionele magnetron gebruikt, die het monster verwarmt tot >95 °C in 10-15 s. Nadelige effecten op de geproduceerde monsters zijn tot nu toe niet waargenomen. Sommige constructies vertonen een kleine tweede band die niet kon worden geëlimineerd door de optimalisatie van de reactieomstandigheden(figuur 3A,baan 4). Meestal zijn deze vrij duidelijk zichtbaar als schouder in het HPLC-chromatogram, als een goed geoptimaliseerd elutiegradiënt wordt gebruikt en kan worden verwijderd (stap 2.2.5). De volgende discussie is bedoeld om kritische stappen in het protocol te benadrukken, met name met betrekking tot het verkrijgen van hoogwaardige gegevens die een interpretatie van de conformatiedynamiek mogelijk maken.

RNase besmetting
Extracellulaire RNases zijn alomtegenwoordig, zeer stabiel en vormen de grootste bedreiging voor de stabiliteit van NMR-monsters op lange termijn. Daarom is het cruciaal om in een RNase-vrije omgeving te werken en alle reagentia en plasticware RNase-vrij te houden. Het gebruik van filtertips en misschien zelfs gezichtsmaskers wordt aanbevolen. Dit is specifiek belangrijk na HPLC-zuivering. NMR-monsters die besmet zijn met RNases vertonen meestal smalle pieken zichtbaar in ¹H-1D spectra na dagen of weken als gevolg van single-nucleotide afbraakproducten. Een dergelijk monster is niet geschikt voor R_{1ρ-metingen.}

NMR-monster
Vanwege het sterk geladen karakter kan RNA worden gebruikt in hoge concentraties zonder neerslag in vergelijking met de meeste eiwitten. Het gebruik van Shigemi NMR-buizen (zie de tabel met materialen)is voordelig omdat ze het centreren van het sterk geconcentreerde monster in het midden van de spoel mogelijk maken, terwijl ze nog steeds ideale shimming- en vergrendelingsomstandigheden bieden vanwege de gevoeligheidsgematchte glazen bodem en plunjer. Op deze manier wordt de B1-inhomogeniteit verminderd, waardoor smallere lijnen ontstaan. Het typische monstervolume in een NMR-buis is 250 μL en de typische concentratie is 1-2 mM. Monsters onder 500 μM worden niet aanbevolen voor RD-experimenten, omdat het experiment te lang zou duren en een goede shim. Evenzo wordt het monstervolume onder 200 μL niet aanbevolen omdat een goede shim- en veldstabiliteit (lock) vereist is. Bij het plaatsen van de zuiger is het van cruciaal belang om de vorming van bellen in het monster te voorkomen (stap 2.4.5). Als dit niet goed is bevestigd, kan de zuiger naar beneden glijden in het monster, waardoor het detecteerbare volume wordt verminderd. Bovendien kunnen snelle temperatuurveranderingen leiden tot de vorming van nieuwe bellen in het monster. Daarom moet voorzichtig worden omgegaan bij het transport van het monster en bij het wijzigen van de temperatuur van de sonde in de NMR-spectrometer. Controleer het monster op bellen wanneer u na een langere periode opnieuw meet.

RNA vouwen
Dynamische RNA-moleculen kunnen in meerdere conformaties bestaan wanneer ze niet goed worden gevouwen. Hoewel smelttemperaturen van secundaire structuren slechts iets boven de kamertemperatuur kunnen liggen, wordt een grondige verwarmings- en snapkoelingsprocedure aanbevolen vóór de meting. Sterk geconcentreerde haarspeldmonsters die onder kinetische controle vouwen (verwarming en snapkoeling) kunnen in de loop van de tijd homodimeren vormen, wat een strenge controle van het vouwen van RNA vóór elke NMR-meting vereist. Als het gemeten RNA geen haarspeldstructuur is, maar een RNA-duplex, moet langzaam vouwen onder thermodynamische controle worden toegepast.

In dit geval moet het koelproces na verhitting binnen het bereik van uren liggen, terwijl het RNA wordt gebruikt bij het uiteindelijke volume en de concentratie in het NMR-monster. Een eerste telling van verwachte imino- en aromatische resonanties kan inzicht geven in de homogeniteit van het monster. Als het monster er niet naar verwachting uitziet, moet het opnieuw worden gevouwen. Mg²⁺ (toegevoegd als chloridezout) kan helpen bij het vouwen van RNA-structuren⁴⁵. In de praktijk dient de vouwbesturing als vergelijking met een monster dat is gebruikt om de NMR-resonanties ten minste gedeeltelijk toe te wijzen en de secundaire structuur experimenteel op te lossen.

Spin lock power en verwarming overwegingen
In het geval van het uitvoeren van de ¹H R_1ρ RD-experimenten als 2D-overzichtsexperimenten, mag het SL-vermogen niet lager zijn dan 1,2 kHz. De radiofrequentiezenderfrequentie moet in het midden van het ppm-gebied van de pieken van belang worden geplaatst(bijv.7,5 ppm voor aromatische protonen). De bandbreedte van 1,2 kHz zal dan groot genoeg zijn om deze protonen te spin-locken zonder grote off-resonantie-effecten. Dergelijke effecten kunnen worden geïdentificeerd in het RD-profiel. Als ze zich voordoen, stijgen de R₂+R_EX-waarden in plaats van dalen met toenemende SL-vermogenswaarden, vooral voor een laag SL-vermogen. Controleer of de berekende SL-vermogenswaarden overeenkomen met het vermogen dat aan het monster wordt geleverd. In de praktijk kan berekend SL-vermogen worden gebruikt als de ¹H 90° harde puls zorgvuldig is gekalibreerd op nieuwere spectrometers; dit kan echter worden gecontroleerd door SL-vermogen te kalibreren voor elke gewenste bandbreedte.

Het bereik van sl-vermogen, dat kan worden gebruikt in ¹H R_1ρ RD-experimenten, is zeer breed, wat leidt tot variërende monsterverwarming (1,2 kHz tot 15 kHz voor HSQC voor HCP-gebaseerde sequenties en 50 Hz tot 15 kHz voor SELOPE-experimenten). Ongelijke monsterverwarming kan worden gedetecteerd als een kleine verandering in chemische verschuiving bij het vergelijken van 1Ds verkregen voor SLs met laag vermogen versus. hoog vermogen SLs. Dit effect wordt meestal niet overwogen in warmtecompensaties in R_1ρ experimenten op heteronuclei. Warmtecompensatie in die experimenten wordt meestal ingesteld om te corrigeren voor verschillende verwarming vanwege de verschillende spinslotduur die is gespecificeerd in de vd-lijst van elke spinslotvermogensreeks. Speciaal voor het SELOPE-experiment moet een tweede warmtecompensatie worden gebruikt voor alle toegepaste SL-sterktes zoals beschreven in²⁰.

vd-lijstoverwegingen
Zoals eerder vermeld, moet de vd-lijst een tijdspunt bevatten dat lang genoeg is om een aanzienlijk verval van de intensiteit te verkrijgen (idealiter tot 30% van het oorspronkelijke signaal, of zo laag mogelijk als het niet mogelijk is om een verval van 70% binnen de specificaties van de sonde te bereiken). Hoewel de vd-lijst is geoptimaliseerd voor een laag SL-vermogen (1,2 kHz), moet deze vd-lijst ook worden getest met het hoogste SL-vermogen dat moet worden gebruikt(bijv.15 kHz). Dit komt door het feit dat voor pieken met een aanzienlijke R_EX-bijdrage het verval veel langzamer zal zijn bij een hoog SL-vermogen. Dus een voldoende verval moet ook worden geverifieerd bij een hoog SL-vermogen. Hetzelfde moet worden overwogen voor verval bij hoge offsets in off-resonantie experimenten. Het ideale maximale tijdspunt van de vd-lijst kan aanzienlijk verschillen voor de verschillende regio’s van het dispersie-experiment. In dat geval kunnen meer punten in de vd-lijst worden opgenomen en kunnen de langere vd-lijstpunten voor een hoger SL-vermogen of hogere offsets tijdens de analyse, op basis van de lage SINO waarnaar ze zullen leiden, worden weggegooid. Over het algemeen moeten 5-8 vd-lijstpunten worden beschouwd als het kunnen herkennen van potentiële artefacten die leiden tot niet-exponentiële vervalsen zoals J-koppeling (zie hieronder).

1D–HCP selectiviteit overwegingen
Speciale zorg moet worden genomen bij het uitvoeren van de HCP-gebaseerde 1D-versie als er nog een piek overlapt met de piek van belang in de ¹H-dimensie van het 2D HSQC-gebaseerde experiment. HCP-gebaseerde transfers zijn zeer, maar nooit 100% selectief, en het kan daarom gebeuren dat een andere piek bijdraagt aan de intensiteit en het vervalgedrag van de piek van interesse in de 1D. Een indicatie hiervoor zou een verschil zijn in R_1ρ-waarden met onresonantie die zijn verkregen met behulp van de 1D- en 2D-versies van het gelabelde experiment.

ROE overwegingen:
Voor off-resonantiecurven van atomen met langzame tussenuitwisseling kunnen ROE-artefacten worden geïdentificeerd op basis van een vergelijking van de verkregen Δω met een NOESY- of ROESY-spectrum. Als een kruispiek kan worden geïdentificeerd bij een chemisch verschuivingsverschil dat overeenkomt met Δω, dan kan de waargenomen opgewekte toestand in feite een ROE-artefact zijn ( er werdenbijvoorbeeldROE’s gevonden tussen aromatische protonen, die allemaal in hetzelfde chemische verschuivingsbereik liggen en daarom worden gedekt door die off-resonantiecurven²⁰). Uit ervaring leidde dit altijd tot slechte pasvormen met grote fouten, mogelijk omdat de ROE niet hetzelfde patroon volgde als R_EX met toenemend SL-vermogen. De situatie wordt moeilijker voor middeld-snelle uitwisseling. Hoewel de on-resonantiecurve (uit vergelijking met ¹³C-gegevens verkregen op de naburige kern) nog steeds representatief is voor het uitwisselingsproces tussen de GS en ES, wordt de off-resonantiecurve beïnvloed door meerdere ROE-artefacten.

In dat geval is de SL-kracht om het uitwisselingsproces te detecteren groter (>1,5 kHz) en beslaat daarom een groter aantal protonen omdat off-resonantiecurven zich uitstrekken over chemische verschuivingsverschillen van verschillende ROE-kandidaten (voor H8 zouden dit zijn: aminoprotonen bij ca. ±1000 Hz, H5/H1’s bij ca. -1200 Hz, imino-protonen bij ca. 3500 Hz). Tot nu toe is geen methode gevonden om deze ROE-artefacten te onderdrukken (behalve het gebruik van gedeeltelijk gedeutereerde nucleotiden⁴⁶), en off-resonantiegegevens mogen niet worden geregistreerd voor snelle tussentijdse uitwisseling, omdat met deze methode geen betrouwbare informatie over de werkelijke Δω kan worden geëxtraheerd, als NOE/ROE-bijdrage niet kan worden uitgesloten via NOESY-spectra.

J-Coupling (Hartmann-Hahn) overwegingen
Hoewel on-resonantiecurven voor homonucleaire J-gekoppelde protonen, zoals H6, met succes zijn geregistreerd¹⁰^,²⁰, moet speciale zorg worden genomen voor off-resonantiemetingen, vooral voor laag SL-vermogen, omdat Hartmann-Hahn matching-omstandigheden een breed scala van de onderzochte offsets kunnen omvatten. Hartmann-Hahn artefacten kunnen worden geïdentificeerd als oscillaties op het exponentiële verval of toenemende R₂+R_EX-waarden met toenemende SL-sterktes in on-resonantie RD plots²⁰.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken de eiwitwetenschappelijke faciliteit (PSF) van het Karolinska Institutet voor de expressie en zuivering van T7 RNA polymerase en E. coli RNase H, Martin Hällberg voor de gulle gift van de anorganische fosfatase en het hele Petzoldlab voor waardevolle discussies. We danken Luca Retattino voor de voorbereiding van de U-bulge constructies en Emilie Steiner en Carolina Fontana voor hun bijdrage aan macro’s en passende scripts. We erkennen het Karolinska Instituut en de Afdeling Medische Biochemie en Biofysica voor de ondersteuning van de aankoop van een 600 MHz spectrometer en positiefinanciering (KI FoAss en KID 2-3707/2013). We zijn dankbaar voor de financiële bijdrage van Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 en FFL15-0178) en De Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald en Greta Jeansson Stiftelse (JS20140009), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 en 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 en M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. erkent financiering via een Marie Skłodowska-Curie IF (EU H2020, MSCA-IF projectnr. 747446).

Materials

40% Acrylamide/Bis Solution	Bio-Rad	161-0144
5-alpha Competent E. coli	NEB	C2987I
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	49199
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
AFC-3000, HPLC Fraction collector	Thermo Scientific	5702.1
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414
Amersham ImageQuant 800 UV	GE Healthcare	29399482	Replacing LAS-4000 or equivalent
Amicon ultra centrifugal filter unit	Sigma-Aldrich	UFC900324
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
ATP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645702
BamHI restriction enzyme	NEB	R0136L
Bottle top filter	VWR	514-1019
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	1081220005
Cleavage guide	IDT	N/A	or equivalent
CTP	Sigma-Aldrich	C1506
CTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645699
D2O	Sigma-Aldrich	151882
Dionex Ultimate 3000 UHPLC system	Thermo Scientific	N/A
DL-Dithiotreitol	Sigma-Aldrich	43815
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
DNAPac PA200 22×250 Semi-Prep column	Thermo Scientific	SP6734
DNAPac PA200 22×50 guard column	Thermo Scientific	SP6731
E.coli RNase H	NEB	M0297L	or made in-house uniprot ref. P0A7Y4
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44	Eppendorf	5804R
Ethanol 95%	Fisher scientific	11574139
Ethanol 95% denatured	VWR	85829.29
Formamide	Sigma-Aldrich	47671
GelRed	VWR	41003
GeneRuler 1kbp Plus	Fisher Scientific	SM1333	Optional
GMP	Sigma-Aldrich	G8377
GMP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	650684
GTP	Sigma-Aldrich	G8877
GTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645680
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H1758
Inorganic pyrophosphatase	Sigma-Aldrich	I1643-100UN	or made in-house uniprot ref. P0A7A9
Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer	Sigma-Aldrich	T4415
Julabo TW8 Water bath	VWR	461-3117
kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis	VWR	700-0056	or comparable
LB broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB broth with agar (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
Low Range ssRNA Ladder	NEB	N0364S	Optional
LPG-3400RS Pump	Thermo Scientific	5040.0036
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	63068
microRNA Marker	NEB	N2102S
Microwave oven	Samsung	MS23F301EAW
Mini-PROTEAN electrophoresis equipment	Bio-Rad	1658004
NucleoBond Xtra Maxi	Machinery-Nagel	740414.10M
pUC19 plasmid containing tandem insert	Genscript	N/A	or equivalent
RNaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020
Shigemi tube 5mm	Sigma-Aldrich	Z529427
Single-use syringe, Luer lock tip	VWR	613-2008
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	730-1470
Sodium perchlorate	Sigma-Aldrich	71853
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S3139
Spermidine trihydrochloride	Sigma-Aldrich	85578
SYBR Gold	ThermoFisher	S11494
Syringe filters	VWR	514-0061
T7 RNA polymerase	Sigma-Aldrich	10881767001	or made in-house uniprot ref. P00573
TCC-3000RS Column thermostat	Thermo Scientific	5730
Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Fisher Scientific	10103203
UMP	Sigma-Aldrich	U6375
UMP-13C9/15N2	Sigma-Aldrich	651370
Urea	Sigma-Aldrich	U5378
UTP	Sigma-Aldrich	U6625
UTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645672
VWD-3100 Detector	Thermo Scientific	5074.0005

Referencias

Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
Doudna, J. A., Cech, T. R. The chemical repertoire of natural ribozymes. Nature. 418 (6894), 222-228 (2002).
Sehgal, P. B., Westley, J., Lerea, K. M., DiSenso-Browne, S., Etlinger, J. D. Biomolecular condensates in cell biology and virology: phase-separated membraneless organelles (MLOs). Analytical Biochemistry. , 597 (2020).
Herschlag, D., Allred, B. E., Gowrishankar, S. From static to dynamic: the need for structural ensembles and a predictive model of RNA folding and function. Current Opinion Structural Biology. 30, 125-133 (2015).
Kimsey, I. J., Petzold, K., Sathyamoorthy, B., Stein, Z. W., Al-Hashimi, H. M. Visualizing transient Watson-Crick-like mispairs in DNA and RNA duplexes. Nature. 519 (7543), 315-320 (2015).
Dethoff, E. A., Petzold, K., Chugh, J., Casiano-Negroni, A., Al-Hashimi, H. M. Visualizing transient low-populated structures of RNA. Nature. 491 (7426), 724-728 (2012).
Baisden, J. T., Boyer, J. A., Zhao, B., Hammond, S. M., Zhang, Q. Visualizing a protonated RNA state that modulates microRNA-21 maturation. Nature Chemical Biology. 17 (1), 80-88 (2021).
Marušič, M., Schlagnitweit, J., Petzold, K. RNA dynamics by NMR spectroscopy. Chembiochem. 20 (21), 2685-2710 (2019).
Baronti, L., et al. Base-pair conformational switch modulates miR-34a targeting of Sirt1 mRNA. Nature. 583 (7814), 139-144 (2020).
Steiner, E., Schlagnitweit, J., Lundström, P., Petzold, K. Capturing excited states in the fast-intermediate exchange limit in biological systems using 1H spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (51), 15869-15872 (2016).
Moschen, T., et al. Ligand-detected relaxation dispersion NMR spectroscopy: dynamics of preQ1-RNA binding. Angewandte Chemie International Edition. 54 (2), 560-563 (2015).
LeBlanc, R. M., Longhini, A. P., Tugarinov, V., Dayie, T. K. NMR probing of invisible excited states using selectively labeled RNAs. Journal of Biomolecular NMR. 71 (3), 165-172 (2018).
Strebitzer, E., Nußbaumer, F., Kremser, J., Tollinger, M., Kreutz, C. Studying sparsely populated conformational states in RNA combining chemical synthesis and solution NMR spectroscopy. Methods. 1148, 39-47 (2018).
Rangadurai, A., Shi, H., Al-Hashimi, H. M. Extending the sensitivity of CEST NMR spectroscopy to micro-to-millisecond dynamics in nucleic acids using high-power radio-frequency fields. Angewandte Chemie International Edition. 59 (28), 11262-11266 (2020).
Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. Using relaxation dispersion NMR spectroscopy to determine structures of excited, invisible protein states. Journal of Biomolecular NMR. 41 (3), 113-120 (2008).
Lundström, P., Akke, M. Off-resonance rotating-frame amide proton spin relaxation experiments measuring microsecond chemical exchange in proteins. Journal of Biomolecular NMR. 32 (2), 163-173 (2005).
Lee, J., Dethoff, E. A., Al-Hashimi, H. M. Invisible RNA state dynamically couples distant motifs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9485-9490 (2014).
Schnieders, R., Keyhani, S., Schwalbe, H., Fürtig, B. More than proton detection- new avenues for NMR spectroscopy of RNA. Quimica. 26 (1), 102-113 (2020).
Fürtig, B., Richter, C., Wöhnert, J., Schwalbe, H. NMR spectroscopy of RNA. Chembiochem. 4 (10), 936-962 (2003).
Schlagnitweit, J., Steiner, E., Karlsson, H., Petzold, K. Efficient detection of structure and dynamics in unlabeled RNAs: The SELOPE approach. Quimica. 24 (23), 6067-6070 (2018).
Feyrer, H., Munteanu, R., Baronti, L., Petzold, K. One-pot production of RNA in high yield and purity through cleaving tandem transcripts. Molecules. 25 (5), 1142 (2020).
Baronti, L., Karlsson, H., Marušič, M., Petzold, K. A guide to large-scale RNA sample preparation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (14), 3239-3252 (2018).
Brunelle, J. L., Green, R. In vitro transcription from plasmid or PCR-amplified DNA. Methods in Enzymology. 530, 101-114 (2013).
Borkotoky, S., Murali, A. The highly efficient T7 RNA polymerase: A wonder macromolecule in biological realm. International Journal of Biological Macromolecules. 118, 49-56 (2018).
Arnaud-Barbe, N., Cheynet-Sauvion, V., Oriol, G., Mandrand, B., Mallet, F. Transcription of RNA templates by T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Research. 26 (15), 3550-3554 (1998).
Guillerez, J., Lopez, P. J., Proux, F., Launay, H., Dreyfus, M. A mutation in T7 RNA polymerase that facilitates promoter clearance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5958-5963 (2005).
Kuzmine, I., Gottlieb, P. A., Martin, C. T. Binding of the priming nucleotide in the initiation of transcription by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 2819-2823 (2003).
Gholamalipour, Y., Karunanayake Mudiyanselage, A., Martin, C. T. 3′ end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character – RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9253-9263 (2018).
Inoue, H., Hayase, Y., Iwai, S., Ohtsuka, E. Sequence-dependent hydrolysis of RNA using modified oligonucleotide splints and RNase H. FEBS Letters. 215 (2), 327-330 (1987).
Wang, X., Li, C., Gao, X., Wang, J., Liang, X. Preparation of small RNAs using rolling circle transcription and site-specific RNA disconnection. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 4, 215 (2015).
Karlsson, H., Baronti, L., Petzold, K. A robust and versatile method for production and purification of large-scale RNA samples for structural biology. RNA. 26 (8), 1023-1037 (2020).
Hartmann, S. R., Hahn, E. L. Nuclear double resonance in the rotating frame. Physical Review. 128 (5), 2042-2053 (1962).
Chiarparin, E., Pelupessy, I., Bodenhausen, G. Selective cross-polarization in solution state NMR. Molecular Physics. 95 (5), 759-767 (1998).
Korzhnev, D. M., Orekhov, V. Y., Kay, L. E. Off-resonance R 1ρ NMR studies of exchange dynamics in proteins with low spin-lock fields: an application to a Fyn SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 713-721 (2005).
Hansen, A. L., Nikolova, E. N., Casiano-Negroni, A., Al-Hashimi, H. M. Extending the range of microsecond-to-millisecond chemical exchange detected in labeled and unlabeled nucleic acids by selective carbon R 1ρ NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 131 (11), 3818-3819 (2009).
Duss, O., Maris, C., von Schroetter, C., Allain, F. H. -. T. A fast, efficient and sequence-independent method for flexible multiple segmental isotope labeling of RNA using ribozyme and RNase H cleavage. Nucleic Acids Research. 38 (20), 188 (2010).
Krähenbühl, B., Lukavsky, P., Wider, G. Strategy for automated NMR resonance assignment of RNA: application to 48-nucleotide K10. Journal of Biomolecular NMR. 59 (4), 231-240 (2014).
LeBlanc, R. M., Longhini, A. P., Le Grice, S. F. J., Johnson, B. A., Dayie, T. K. Combining asymmetric 13C-labeling and isotopic filter/edit NOESY: a novel strategy for rapid and logical RNA resonance assignment. Nucleic Acids Research. 45 (16), 146 (2017).
Parisien, M., Major, F. The MC-Fold and MC-Sym pipeline infers RNA structure from sequence data. Nature. 452 (7183), 51-55 (2008).
Fürtig, B., Richter, C., Bermel, W., Schwalbe, H. New NMR experiments for RNA nucleobase resonance assignment and chemical shift analysis of an RNA UUCG tetraloop. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 69-79 (2004).
Keyhani, S., Goldau, T., Blümler, A., Heckel, A., Schwalbe, H. Chemo-enzymatic synthesis of position-specifically modified RNA for biophysical studies including light control and NMR spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (37), 12017-12021 (2018).
Marchanka, A., Kreutz, C., Carlomagno, T. Isotope labeling for studying RNA by solid-state NMR spectroscopy. Journal of Biomolecular NMR. 71, 151-164 (2018).
Becette, O., Olenginski, L. T., Dayie, T. K. Solid-phase chemical synthesis of stable isotope-labeled RNA to aid structure and dynamics studies by NMR spectroscopy. Molecules. 24 (19), 3476 (2019).
Zhang, X., Li, M., Liu, Y. Optimization and characterization of position-selective labelling of RNA (PLOR) for diverse RNA and DNA sequences. RNA Biology. 17 (7), 1009-1017 (2020).
Roh, J. H., et al. Effects of preferential counterion interactions on the specificity of RNA folding. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (19), 5726-5732 (2018).
Juen, M. A., et al. Excited states of nucleic acids probed by proton relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie German Edition. 55 (39), 12008-12012 (2016).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Feyrer, H., Schlagnitweit, J., Petzold, K. Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of ¹H R_1ρ Relaxation Dispersion Experiments of RNA. J. Vis. Exp. (173), e62470, doi:10.3791/62470 (2021).