치아 줄기 세포의 조절 연구를 위한 트로웰형 장기 배양 사용
Summary
Trowell 형 장기 배양 방법은 치아 발달을 제어하는 복잡한 신호 네트워크를 밝히고 최근에는 지속적으로 성장하는 마우스 앞니의 줄기 세포와 관련된 조절을 연구하는 데 사용되었습니다. 형광 리포터 동물 모델과 라이브 이미징 방법은 치과 줄기 세포와 특정 틈새 미세 환경에 대한 심층 분석을 용이하게합니다.
Abstract
장기 발달, 기능 및 재생은 줄기 세포 틈새라고하는 별개의 해부학 적 공간 내에있는 줄기 세포에 의존합니다. 지속적으로 성장하는 마우스 앞니는 조직 특이적 줄기 세포를 연구하기 위한 우수한 모델을 제공합니다. 앞니의 상피 조직 특이 적 줄기 세포는 자궁 경부 루프라고하는 틈새에서 치아의 근위 끝에 있습니다. 그들은 치아의 자체 날카롭게하는 팁의 지속적인 마모를 상쇄하기 위해 세포의 지속적인 유입을 제공합니다. 여기에 제시된 것은 줄기 세포와 그 틈새를 수용하는 마우스 앞니의 근위 말단의 분리 및 배양에 대한 자세한 프로토콜입니다. 이것은 금속 격자로 지지되는 필터의 액체/공기 계면에 있는 두꺼운 조직 조각뿐만 아니라 조직 조각(체외이식편)의 체외 배양을 가능하게 하는 수정된 Trowell 유형 장기 배양 프로토콜입니다. 여기에 설명된 장기 배양 프로토콜은 생체 내에서 불가능한 조직 조작을 가능하게 하며, 형광 리포터의 사용과 결합하면 줄기 세포를 포함하여 시간이 지남에 따라 살아있는 조직에서 개별 세포 집단을 식별하고 추적할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 다양한 조절 분자 및 약리학 적 화합물이이 시스템에서 줄기 세포 및 그 틈새에 미치는 영향을 테스트 할 수 있습니다. 이것은 궁극적으로 줄기 세포 조절 및 유지를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
Introduction
마우스 앞니는 치아 구성 요소의 끊임없는 생산을 지원하는 줄기 세포 (SC)의 평생 보존으로 인해 지속적으로 성장합니다. 여기에는 법랑질 생성 흑색 모세포를 생성하는 상피 SC와 다른 세포중에서 상아질 생성 치모 세포를 생성하는 중간엽 줄기 세포(MSC)가 포함됩니다1. 지속적으로 성장하는 앞니의 상피 SC는 처음에는 표지 유지 세포 2,3으로 확인되었으며 이후 Sox24를 포함한 여러 잘 알려진 줄기 유전자를 발현하는 것으로 나타났습니다. 이 세포는 다른 기관의 상피 SC와 공통된 특징을 공유하며 앞니의 순음쪽에 위치한 자궁 경부 루프라고하는 SC 틈새 내에 있습니다. 틈새는 SC 활성을 조절하는 세포와 세포외 기질로 구성된 동적 실체입니다5. 계통 추적 연구에 따르면 Sox2+ 상피 SC는 치아의 전체 상피 구획을 재생할 수 있으며 연속적인치아 형성에 중요합니다6,7. 상아질 회복 또는 재생 잠재력을 가진 MSC는 혈관 및 신경 8,9,10,11을 통해 기관 외부에서 주로 모집되므로 MSC 인구의 모집, 이동 및 주거를 연구하는 데 적합한 모델을 제공합니다.
생체 내에서 SC를 연구하는 것은 많은 유전 적 및 / 또는 약리학 적 조작이 장기 항상성에 영향을 미치거나 치명적인 결과를 초래할 수 있기 때문에 항상 가능한 것은 아닙니다. 따라서 장기 배양은 SC의 조절과 그 틈새를 시험관 내에서 연구하는 훌륭한 도구를 제공합니다. 금속 격자를 사용하는 장기 배양 시스템은 처음에 장기 발달을 연구하기 위해 Trowell12에 의해 개발되었으며 신장 발달에서 유도 신호를 연구하기 위해 Saxen13에 의해 추가로 수정되었습니다. 그 이후로, 장기의 전체 또는 일부를 배양하는이 시험관 내 방법은 다른 분야에서 성공적으로 적용되었습니다. 치아 발달 분야에서이 방법은 치아 발달14 및 연속 치아 형성15을 제어하는 상피-중간 엽 상호 작용을 연구하는 데 널리 사용되었습니다. Thesleff 실험실의 연구는 치아 성장 및 형태 형성의 시간적 분석, 치아 성장에 대한 다양한 분자 및 성장 인자의 영향 분석, 치아 발달의 시간 경과 라이브 이미징을 위해이 시스템의 유용성을 입증했습니다16,17. 보다 최근에이 방법은 앞니 SC 및 그 틈새18,19의 조절을 연구하는 데 활용되었으며, 이는 여기에 자세히 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
체외 장기 배양은 장기 성장 및 형태 형성을 제어하는 유도 잠재력 및 상피-중간엽 상호 작용을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. Thesleff 실험실은 Trowell 유형 장기 배양의 Saxén 변형을 적용하고 치아 발달을 연구하는 데 사용하는 방법을 보여주었습니다14. 형광 리포터의 재현 가능한 조건과 발전으로 인해 치아 형태 형성과 그 안의 뚜렷한 세포 집단을 모니터링하…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Jane and Aatos Erkko Foundation의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
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