التحقيق في البلعمة من الليشمانيا باستخدام المجهر البؤري
Summary
الآلية المرتبطة البلعمة في عدوى الليشمانيا لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. هنا ، نصف طرق لتقييم الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء تفاعل الليشمانيا مع الخلايا المضيفة.
Abstract
البلعمة هي عملية منسقة تتضمن خطوات متميزة: التعرف والربط والاستيعاب. تأخذ الخلايا البلعمية الاحترافية طفيليات الليشمانيا عن طريق البلعمة ، والتي تتكون من التعرف على الأربطة على أسطح الطفيليات بواسطة مستقبلات الخلايا المضيفة المتعددة. يحدث ارتباط الليشمانيا بأغشية البلاعم من خلال مستقبلات المكمل من النوع 1 (CR1) والمستقبلات المكملة من النوع 3 (CR3) ومستقبلات التعرف على الأنماط. Lipophosphoglycan (LPG) و 63 kDa glycoprotein (gp63) هي الروابط الرئيسية المشاركة في تفاعلات البلاعم والليشمانيا . بعد التعرف الأولي على روابط الطفيليات بواسطة مستقبلات الخلايا المضيفة ، تصبح الطفيليات داخلية وتبقى على قيد الحياة وتتكاثر داخل الفجوات الطفيلية. تتضمن عملية نضج الفجوات التي يسببها الليشمانيا الحصول على جزيئات من الحويصلات داخل الخلايا ، بما في ذلك بروتين G الأحادي Rab 5 و Rab 7 ، وبروتين الغشاء المرتبط بالليزوسومات 1 (LAMP-1) ، وبروتين الغشاء المرتبط بالليزوسومات 2 (LAMP-2) ، والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 1A / 1B-light chain 3 (LC3).
هنا ، نصف طرقا لتقييم الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء تفاعل الليشمانيا مع الخلايا المضيفة باستخدام المجهر البؤري ، بما في ذلك (i) الربط (ii) الاستيعاب ، و (iii) نضج البلعمة. من خلال إضافة مجموعة المعرفة المحيطة بهذه المحددات لنتائج العدوى ، نأمل في تحسين فهم التسبب في عدوى الليشمانيا ودعم البحث النهائي عن أهداف جديدة للعلاج الكيميائي.
Introduction
داء الليشمانيات هو مرض استوائي مهمل تسببه طفيليات البروتوزوان من جنس الليشمانيا ، مما يؤدي إلى مجموعة واسعة من المظاهر السريرية في مضيف الفقاريات ، بما في ذلك داء الليشمانيات الجلدي ، داء الليشمانيات المخاطي الجلدي وداء الليشمانيات الحشوي 1. تقدر منظمة الصحة العالمية (WHO) أن أكثر من مليار شخص معرضون للخطر ، مع الإبلاغ عن أكثر من مليون حالة جديدة سنويا2.
الليشمانيا spp. هي بدائيات ملزمة داخل الخلايا التي تعيش داخل الخلايا المضيفة ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة والبلاعم والخلايا المتغصنة3. تفاعل الليشمانيا والبلاعم هو عملية معقدة تنطوي على مستقبلات متعددة للخلايا المضيفة وروابط طفيليات إما من خلال التفاعل المباشر أو عن طريق opsonization التي تنطوي على مستقبلات تكميلية 4,5. مستقبلات السطح الكلاسيكية ، مثل CR1 ، CR3 ، mannose-fucose ، fibronectin ، مستقبلات تشبه الرسوم والزبال ، تتوسط ارتباط الطفيلي بالبلاعم 6,7,8. تتعرف هذه المستقبلات على الجزيئات الموجودة على سطح الليشمانيا ، بما في ذلك البروتين السكري 63 kDa (gp63) و glycolipid lipophosphoglycan (LPG)9. هذه هي الجزيئات الأكثر وفرة على سطح promastigotes وتلعب دورا أساسيا في تخريب الاستجابة المناعية للمضيف ، وتفضل إنشاء عدوى الطفيليات في خلايا الثدييات10. بعد أن ترتبط روابط سطح الطفيليات بمستقبلات البلاعم ، يتراكم F-actin على أسطح خلايا الثدييات ، والطفيليات المحيطة بها أثناء البلعمة. في وقت لاحق ، يؤدي هذا إلى تكوين حجرة مستحثة بالطفيليات تسمى الفجوة الطفيلية (PV) ، والتي تقدم ميزات البلعمة11. بمجرد دخول هذه البلعمة ، تخضع الطفيليات لعدة تعديلات ضرورية للبقاء على قيد الحياة والتكاثر3.
التولد الحيوي للكهروضوئيات هو عملية اتجار غشاء عالية التنظيم حاسمة لبقاء هذا العامل الممرض داخل الخلايا12. ينتج تكوين هذه المقصورة عن أحداث اندماج متسلسلة بين البلعمة ومقصورات المسار الداخلي للمضيف. كشفت دراسات بيولوجيا الخلية الكلاسيكية أن نضوج الخلايا الكهروضوئية ينطوي على الحصول على بروتين G الأحادي Rab 5 و Rab 7 ، والتي ترتبط بشكل رئيسي بنضج البطانة المبكرة والمتأخرة ، على التوالي13. بالإضافة إلى ذلك ، تكتسب هذه المقصورات بروتينات الغشاء المرتبطة بالليزوسوم 1 و 2 (LAMP 1 ، LAMP 2) ، ومكونات البروتين الرئيسية للغشاء الليزوزومي والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 1A / 1B – سلسلة الضوء 3 (LC3) ، وهي علامة البلعمة الذاتية14. على الرغم من أوجه التشابه الواضحة ، فإن حركية التكوين الكهروضوئي 15,16 ومورفولوجيا هذه المقصورات تختلف اعتمادا على أنواع الليشمانيا. على سبيل المثال ، العدوى التي تسببها L. mexicana أو L. amazonensis تحفز على تكوين مقصورات كبيرة تحتوي على عدد كبير من الطفيليات17. على النقيض من ذلك ، تشكل الأنواع الأخرى ، مثل L. braziliensis و L. infantum ، فجوات أصغر تحتوي عادة على طفيلي واحد أو اثنين فقط في كل فجوة18.
على الرغم من هذه المعرفة المحيطة بتفاعل خلية المضيف مع الليشمانيا ، إلا أن الأحداث الأولية الناجمة عن الاتصال بين مستقبلات المضيف وروابط الطفيليات لم يتم توضيحها بالكامل. ومن المعروف أن هذه الأحداث هي محددات لنتائج العدوى الطفيلية وتعتمد على أنواع الطفيليات ، ونوع مستقبلات الخلايا المضيفة التي تم تجنيدها للتعرف على الطفيليات وتنشيط مسارات إشارات البلاعم 19,20. لذلك ، من الضروري تحديد الجزيئات المشاركة في التكوين الحيوي للكائنات الكهروضوئية التي يسببها الليشمانيا وتحديد الدور (الأدوار) التي تلعبها هذه الجزيئات في إنشاء العدوى ونتائجها. هنا ، نصف طريقة لرصد الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء البلعمة في الليشمانيا ، بما في ذلك الربط والاستيعاب وتكوين البلعمة والنضج. يمكن أن يساعد هذا العمل في توضيح مشاركة PLC و Akt و Rab5 و Rab7 و LC3 في تكوين PVs التي تسببها أنواع مختلفة من الليشمانيا. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في مشاركة البروتينات الأخرى المشاركة في النضج الكهروضوئي. ستوسع الدراسات المستقبلية المعرفة المحيطة بالآليات المشاركة في تفاعل الخلايا المضيفة بين الليشمانيا وتساهم في تصميم استراتيجيات جديدة للعلاج الكيميائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
التفاعل بين الليشمانيا والبلاعم هو عملية معقدة وينطوي على العديد من الخطوات التي يمكن أن تؤثر على تطور المرض5. لفهم أفضل للآليات التي ينطوي عليها تفاعل الليشمانيا غير المتعثرة والخلايا المضيفة ، وصفنا بروتوكولا يستخدم المجهر الفلوري البؤري لتقييم البلعمة من المراحل ال?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر معهد غونسالو مونيز وفيوكروز باهيا بالبرازيل وقسم الفحص المجهري على المساعدة. تم دعم هذا العمل من قبل INOVA-FIOCRUZ رقم 79700287000 ، P.S.T.V. حاصل على منحة للإنتاجية في الأبحاث من CNPq (305235/2019-2). تم تقديم البلازميدات بلطف من قبل موريسيو تيريبيزنيك ، جامعة تورنتو ، كاليفورنيا. يود المؤلفون أن يشكروا أندريس ك. والتر على مراجعة اللغة الإنجليزية والمساعدة في تحرير نسخ المخطوطات.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
Referencias
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
- World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).
- Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
- Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
- Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
- Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
- Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
- Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
- Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
- Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
- Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
- Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
- Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
- Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
- Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
- Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
- Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
- Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
- Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
- English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
- Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
- Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
- Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
- Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
- Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
- Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
- Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
- Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
- Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).
- Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
- Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).
- Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).
