蛍光色素、ローダミンBを用いて、オス のアエデスアエジプティ 蚊の交配競争力を研究する

1. 蚊の飼育 27±1 °Cおよび75-80%相対湿度の標準的な昆虫条件下ですべての蚊の飼育と男性の交配競争力アッセイを行い、光周期は12時間:12時間光:暗いサイクル。 競合する 2 組の男性をセット A とセット B として指定し、このペーパーで説明する方法論で簡単に参照できます。標準化された条件下で蚊を飼育し、アッセイ中の適性を公正に比較します。2 Lの水の中で500匹の幼虫の幼虫密度で蚊を飼育し、挽いた魚の食品粉末 アドリビタムでそれらを供給します。注:代表的な結果の生成のために、セットAとセットBは ウォルバキアの近親およびアウトクロス男性でした – 感染 したAe。アエジプティ、それぞれ。 プパル段階でオスとメスの蚊をセックスし、サイズの寸法W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cmのケージ( 材料表を参照)に別々に含み、メッシュサイズは150 x 150と160 μmの開口部を持ちます。10%のスクロース溶液ですべての成虫の蚊を維持します。 2. オスとメスの蚊の調製 そのサイズの違いに応じて、プパル段階でオスとメスの蚊をセックスする(雄の子犬は雌の子犬より小さい)(図1)。 蚊のセット(セットAまたはセットB)ごとに、100個のオスの子犬を、スクロース給餌またはRhB-sucrose給餌のために事前にラベル付けされたケージにそれぞれ移します。 ケージあたり40〜50の小さなバッチにメスの子犬を置きます。イマゴの出現時に、オスの蚊の存在がないかケージをチェックしてください。注:雄の雄の蚊は雌よりも小さく、ふさふさした毛状のアンテナを持っています(図2)。交配競争力アッセイには、処女雌の蚊のみを使用してください。授精前の女性を使用すると、結果として得られるすべてのデータが無効になります。したがって、極端な注意は、子犬の段階でセックス中に取られなければなりません。オスの蚊に汚染されたケージから雌の蚊を使用しないでください。女性の余分なケージを準備する必要があります。 3. 0.2% RhB – スクロース溶液の調製 注:RhBは乾燥した形の緑色の粉末で、溶液中の赤みを帯びたピンクです。標準的な個人用保護具(PPE:実験室保護ガウン、ニトリル手袋、および眼保護)は、この化学物質を取り扱う際に着用する必要があります。吸入を避けるために、ヒュームフードでRhB粉末の重量を量る。 0.2%w/v RhB-sucrose溶液を調製するには、100 mLの100 mL毎に200mgのRhB粉末を溶解し、スクロース溶液を10%w/v/スクロース溶液にします。すべての粉末が溶解していることを確認するためによく混合します。注:RhBは光に敏感なので、アンバーボトルを使用するか、透明なボトルをアルミホイルで完全に包みます。 4. オスの蚊の餌 注: RhB-sucrose の供給最適化のデータは 補足資料、セクション 1に示されています。 芯付きの20個の砂糖フィーダーボトルを準備します。10本のフィーダーボトルに10%のスクロース10mL、他の10本のフィーダーボトルに0.2%RhB-ショ糖溶液10mLを加えます(アンバーボトルを使用するか、ボトルをアルミホイルで包みます)。 ステップ2.2および2.3で準備したそれぞれのオスケージ(ケージあたり5本)にフィーダーボトルを入れます。オスの蚊が交配実験の前に3日間餌を与えることを許可する。 5. 雄の蚊の蛍光の検査 RhB-sucroseを供給した雄の蚊を吸引し、蛍光ステレオ顕微鏡で観察し、RhB-sucroseを供給されたすべての雄の蚊がRhBで正常にマークされていることを確認します。 水銀バーナーランプとステレオ顕微鏡をオンにします。水銀バーナーランプの光源を10分間安定させます。赤色蛍光タンパク質1(RFP1)の蛍光フィルター(励起波長540nm、発光波長625nm)を設定します。 口腔吸引器のガラス管に一度に少数の蚊(4または5)を吸引する。ガラス管を通して、蛍光ステレオ顕微鏡でオスの蚊の体を観察します。RhBでマークされていないオスの蚊を実験から除外します。注: RhB でマークされたオスの蚊の腹部は、白色光の下にピンク色に表示され(図3A)、蛍光灯下で明るいオレンジ色に輝きます(図3B)。 移管セットAオスの蚊を12個の紙コップに入れ、網で固定(メッシュサイズ150 x 150、160 μm開口)それぞれ6カップに10個のショ糖を与えたオスの蚊と、他の6カップにそれぞれ10個のRhB-sucroseを与えたオスの蚊を入れた。セットBオスの蚊に対してこの手順を繰り返します。 6. 競争力の合体アッセイ 12 W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm ケージをメッシュサイズ 44 x 32,650 μm のアパーチャーで設定します。6つのケージのそれぞれに、10セットA(RhBマーク)オスの蚊、10セットB(無印)オスの蚊、10匹の処女野生型メス蚊が含まれています。他の6つのケージには、10セットA(無印)のオスの蚊、10セットB(RhBマーク)オスの蚊、および10個の処女野生型雌蚊が含まれます。これらのケージにラベルを付け、2つの交配の組み合わせを明確に区別します。注:経験に基づいて、60 cm x 60 cm x 60 cmケージは、より小さなケージが混合交配を奨励する可能性があるため、交配アッセイに使用されました。 ステップ5.4で準備したオスのそれぞれのカップをステップ6.1のラベルに従って交配ケージに入れます。網を取り出し、カップを軽くタップして、オスをカップから出します。ケージから蚊が逃げないように、慎重に紙コップと網をケージから取り外します。オスの蚊が交配ケージに少なくとも1時間順応するようにします。 経口吸引器を使用して、処女野生型メスの蚊を12個の紙コップに移し、各カップに10個の蚊を含みます。 オスの蚊の順応期間の後、すべての交配ケージにメスの1カップを移し、網を取り除きます。カップから残っているメスの蚊を励ますために、カップをそっと揺らします。ケージから蚊が逃げないように、慎重に紙コップと網をケージから取り外します。 3時間の交配を行うことを許可します。注:推奨交配期間は、野生型 Aeaegyptiの以前の観察によって決定されました。60cm x 60cm x 60cmケージに収容されている10人の女性と20人の男性を含む実験では、90%の女性授精が3時間(補足材料、セクション2)で達成された。攪拌が中断し、混合交配につながる可能性がありますので、この期間中にケージを邪魔しないでください。混合交配(女性がマークされた男性とマークされていない男性の両方と交配した場所)は、蛍光顕微鏡の下でRhBマークされた精子と無印の精子を区別することが困難であるため、RhBマークされた男性に偏りをもたらす。 交配実験を終了するには、機械吸引器を使用して各ケージからすべての蚊を取り除きます。氷上の蚊を少なくとも5分間冷たい麻酔をします。蚊が完全に麻酔されたら、雌の蚊をそっと拾い、網で固定された別の紙コップに入れます(メッシュサイズ150 x 150、160 μm開口)。合間ケージから用紙カップにそれぞれのラベルを転送して、紙コップにラベルを付けます。注:この時点で実験を一時停止し、10%のスクロース溶液でメスを維持することが可能です。RhBマークされた精液は、少なくとも1週間は女性の精子の中で安定したままである。死んだ標本や乾燥した標本が解剖が困難であるため、解剖前にメスを生き続けることが最善です。 女性の精子を採点するには、氷上の雌の蚊を少なくとも5分間氷上で麻酔してから、ステレオ顕微鏡で解剖する(ビデオ1)。その授精状態について、化合物の光顕微鏡(倍率100x)の下で精子を調べる(図4)。授精された個体の場合、RFP1フィルターとカメライメージングシステムを備えた蛍光ステレオ顕微鏡の下で検査することにより、精子にRhB印の精液が含まれているかどうかを判断します。注:画像システムを取り付けた蛍光ステレオ顕微鏡を使用する場合、長時間の露光時間(5)を利用して検出感度を高めることが推奨されます。雌の蚊がマークされた男性と交尾した場合、彼女の精子は明るいオレンジ色を蛍光します(図5A)。しかし、メスの蚊が無印の雄と交尾した場合、彼女の授精精子は蛍光を発しない(図5B)。 7. RhB廃棄物の処分 活性炭25 でRhB水性廃棄物を一般排水として排出する前に処理します。固形RhB廃棄物(RhBでマークされた蚊、ペーパータオル、RhBを浸した芯)を化学廃棄物として処分します。RhB廃棄物を処理する際は、標準PPEを使用してください。