高通量抗病毒检测筛查寨卡病毒复制抑制剂
Summary
在这项研究中，我们描述了用于基于雷普利康和病毒酶的检测的协议，以高通量筛选格式筛选寨卡病毒复制的抑制剂。
Abstract
抗病毒药物的发现需要开发可靠的生化和细胞检测，这些检测可以以高通量筛选 （HTS） 格式进行。黄病毒非结构性（NS）蛋白被认为在内质（ER）膜上共同转化组装，形成复制复合物（RC）。NS3和NS5是RC研究最多的酶，由于它们在病毒基因组复制中的关键作用，它们构成了药物开发的主要目标。NS3 蛋白酶域，需要 NS2B 作为其共同成因，负责将未成熟的病毒聚蛋白转化为成熟的 NS 蛋白，而 NS5 RdRp 域负责 RNA 复制。在此，我们详细描述了用于基于雷普利肯的筛查和酶检测中用于测试大型复合库以抑制寨卡病毒 （ZIKV） 复制的协议。复制物是哺乳动物细胞中表达的自复制亚基因组系统，其中病毒结构基因被报告基因所取代。化合物对病毒RNA复制的抑制作用可以通过测量受体蛋白活性的减少来轻松评估。基于重新筛选的是使用BHK-21 ZIKV雷普利康细胞系表达 蕾妮拉 ·卢西费拉斯作为记者基因进行的。为了描述已识别化合物的具体目标，我们建立了体 外 荧光检测，用于重组表达的NS3蛋白酶和NS5 RdRp。病毒蛋白酶的蛋白酶的蛋白酶活性是使用氟性肽基板Bz-nKRR-AMC测量的， 而NS5 RdRp拉长活性直接通过在RNA拉长过程中SYBR Green I的荧光信号增加而检测到，使用合成生物素化自撬模板3+UTR-U30（5′-生物素-U30-ACUGGAUCGAUCUCAGU-3’）。
Introduction
寨卡病毒（ZIKV）是一种新兴的节肢动物传播病毒成员的弗拉维病毒属，其中包括密切相关的登革热病毒（DENV）、日本脑炎病毒（JEV）和黄热病病毒（YFV），它们对公众健康构成持续威胁。2015-16年，由于与严重的神经系统疾病（如新生儿2、3和4岁成人的吉兰-巴雷综合征）相关，在巴西出现ZIKV疫情后，引起了全球的关注。虽然感染病例数量在未来两年内有所下降，但2019年在87个国家和地区验证了ZIKV的蚊子传播，从而证明了该病毒重新成为流行病的可能性。迄今为止，还没有批准的疫苗或有效药物来预防ZIKV感染。
抗病毒药物的发现需要开发可靠的细胞和生化检测，可以以高通量筛选 （HTS） 格式进行。基于雷普利肯的筛选和病毒酶为基础的检测是测试ZIKV1抑制剂的小分子化合物的两种有价值的策略。黄病毒非结构性（NS）蛋白被认为在内质质视网膜（ER）膜上共同转化组装，形成复制复合物（RC）6。NS3和NS5是RC研究最多的酶，由于它们在病毒基因组复制中的关键作用，它们构成了药物开发的主要目标。NS3蛋白酶域，这需要NS2B作为其共同成因，负责将未成熟的病毒聚蛋白乳化成成熟的NS蛋白，而NS5 RdRp域负责RNA复制6。
复制物是哺乳动物细胞中表达的自复制亚基因组系统，其中病毒结构基因被报告基因所取代。化合物对病毒RNA复制的抑制作用可以通过测量报告蛋白活性的减少来轻松评估。在此，我们描述了用于以 96 井板格式筛选 ZIKV 复制抑制剂的协议。基于雷普利肯的测定是使用BHK-21 ZIKV Rluc 雷利康细胞系进行的，我们最近开发了8个。为了描述已识别化合物的具体目标，我们建立了体 外 荧光基测定，使用荧光肽基板对NS3蛋白酶进行重组表达， Bz-nKRR-AMC，而对于NS5 RdRp，我们测量了合成生物染色自燃模板3+UTR-U30（5′-生物素-U30-阿库加高高库-3’）的拉长，使用相互扩展的染料SYBR绿色I。
ZIKV 蛋白酶 （45-96 NS2B 共因子的残留物与 NS3 蛋白酶域的残留物 1-177 由甘氨酸丰富的链接器 [G4SG4]）获得， 如YFV9所述，而聚合酶（RdRp域的276-898残留物）被克隆和表达，详见10。这两种酶序列都来自根班克ALU33341.1。作为初级抗病毒筛查，化合物在 10 μM 下进行测试，然后以依赖剂量的方式评估那些显示活动≥ 80% 的化合物，从而产生有效/抑制 （EC50 或 IC50）和细胞毒性 （CC50）浓度。在具有代表性的结果中，EC50 和 CC50 值的 NITD008，一种已知的黄病毒抑制剂11，从基于雷利康的筛选显示。在酶测定方面，显示了MMV/DNDi大流行反应盒中两种化合物的IC50 值，该库由400个具有抗菌、抗真菌和抗病毒作用的分子组成。本工作中描述的协议可以修改为筛选其他相关黄病毒的抑制剂。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处描述的协议可以很容易地适应 384 或 1536 井格式的放映。对于以 HTS 格式进行的生化和/或基于细胞的筛选，每个板计算 Z 的因子值（统计参数），以确保这些检测12的灵敏度、可重复性和准确性。基于重新筛选的 Z 的因子值预计为 0.5 或以上，而 NS3 和 NS5 活动检测的系数值预计为 0.7 或以上。对于基于雷普利康的 HTS，我们开发了 BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo 细胞，这是一个稳定的细胞?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了圣保罗埃斯塔多·埃斯塔多基金会（FAPESP）的支持，CEPID赠款2013/07600-3用于去， 向无国界记者组织提供2018/05130-3，向阿布沙韦提供2016/19712-9赠款，向阿布沙斯高级津贴授予2016年15月153日，向阿布沙斯高级津贴授予2016153/2020-00。我们要感谢疟疾风险医学项目（MMV，www.mmv.org）和被忽视疾病药物倡议（DNDi，www.dndi.org）的支持，大流行反应箱的设计和供应化合物。
Materials
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | – | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarine) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | – | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
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