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Bioingeniería

Mikroinjektion von Maiszikade, Peregrinus maidis, Embryonen für die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung

Published: March 26, 2021
doi:
10.3791/62417
, , , , , ,
1Department of Entomology and Plant Pathology,North Carolina State University

Summary

Hierin werden Protokolle zur Entnahme und Mikroinjektion von präzellulären Maiszikadenembryonen zum Zwecke der Modifikation ihres Genoms durch CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editierung oder zur Zugabe markierter transponierbarer Elemente durch Keimbahntransformation vorgestellt.

Abstract

Die Maiszikade, Peregrinus maidis, ist ein Schädling des Mais und ein Überträger mehrerer Maisviren. Bisher publizierte Methoden beschreiben die Auslösung von RNA-Interferenz (RNAi) in P. maidis durch Mikroinjektion von doppelsträngigen RNAs (dsRNAs) in Nymphen und adulte Tiere. Trotz der Leistungsfähigkeit von RNAi sind Phänotypen, die mit dieser Technik erzeugt werden, transient und haben keine langfristige Mendelsche Vererbung. Daher muss der Werkzeugkasten von P. maidis um funktionelle genomische Werkzeuge erweitert werden, die die Produktion stabiler mutierter Stämme ermöglichen und den Forschern die Tür öffnen, um neue Bekämpfungsmethoden gegen diesen wirtschaftlich wichtigen Schädling einzusetzen. Im Gegensatz zu den dsRNAs, die für RNAi verwendet werden, können die Komponenten, die bei der CRISPR/Cas9-basierten Genom-Editierung und Keimbahntransformation verwendet werden, die Zellmembranen jedoch nicht ohne weiteres durchdringen. Infolgedessen müssen Plasmid-DNAs, RNAs und/oder Proteine in Embryonen mikroinjiziert werden, bevor der Embryo zellularisiert, was den Zeitpunkt der Injektion zu einem kritischen Faktor für den Erfolg macht. Zu diesem Zweck wurde eine Agarose-basierte Eiablagemethode entwickelt, die es ermöglicht, Embryonen von P. maidis-Weibchen in relativ kurzen Abständen zu ernten. In dieser Arbeit werden detaillierte Protokolle für die Entnahme und Mikroinjektion von präzellulären P. maidis-Embryonen mit CRISPR-Komponenten (Cas9-Nuklease, die mit Guide-RNAs komplexiert wurde) vorgestellt, und die Ergebnisse des Cas9-basierten Gen-Knockouts eines P. maidis Augenfarbengens, weiß, werden vorgestellt. Obwohl diese Protokolle die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung in P. maidis beschreiben, können sie auch für die Herstellung transgener P. maidis durch Keimbahntransformation verwendet werden, indem einfach die Zusammensetzung der Injektionslösung verändert wird.

Introduction

Die Maiszikade, Peregrinus maidis, ist ein wirtschaftlich bedeutsamer Schädling von Mais 1,2,3. Sie verursachen direkte physische Schäden an der Pflanze, sowohl während der Nahrungsaufnahme mit ihren stechend-saugenden Mundwerkzeugen als auch während der Fortpflanzung, wenn sie ihre Embryonen direkt in das Pflanzengewebe legen 2,4. Trotz der vielfältigen direkten Schädigung von Nutzpflanzen haben diese Insekten den größten Einfluss auf die Pflanzengesundheit indirekt, da sie als Vektor des Maismosaikvirus (MMV) und des Maisstreifenvirusfungieren 5,6. MMV ist in der Lage, sich im Körper seines P. maidis-Vektors zu vermehren, so dass das Virus in einzelnen Insekten während ihres gesamten Lebens persistieren kann, so dass sie das Virus weiterhin auf neue Wirtspflanzen übertragen können 7,8. Die gebräuchlichsten Methoden zur Bekämpfung von P. maidis und damit der Viren, die er überträgt, sind Insektizide.

Leider hat die Misswirtschaft dieser Produkte zur Entwicklung von Resistenzen beim Zielschädling sowie zur Verschmutzung der Umwelt geführt9. Daher sind neue Strategien erforderlich, um die Ernteverluste durch diese Insekten-Virus-Schädlings-Kombination zu reduzieren. Frühere Arbeiten zeigten, dass RNA-Interferenz (RNAi) eine wirksame Kontrollmethode für P. maidis sein könnte, da sie auch bei der Aufnahme von doppelsträngiger RNA (dsRNA) anfällig für eine Herunterregulierung der Genexpression sind10. Der effektivste Weg, dsRNA auf dem Feld zu verabreichen, wäre jedoch über die Pflanzen, von denen sich die Insekten ernähren. Daher könnten Nutzpflanzen immer noch anfällig für Viren sein, die die Insekten bereits in sich tragen. Mit dem Aufkommen der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung sind neue Schädlingsbekämpfungsstrategien möglich, darunter der Cas9-basierte Gene Drive11,12, der verwendet werden könnte, um die Größe einer Schädlingspopulation zu reduzieren oder diese Population durch Individuen zu ersetzen, die gegen die Viren resistent sind, die sie übertragen.

Die Entwicklung und der Einsatz jeglicher Art von Gene-Drive-Systemen erfordert jedoch die Entwicklung transgener Techniken. Solche Methoden waren für die Durchführung von RNAi-Experimenten in P. maidis nicht erforderlich, da angenommen wird, dass dsRNAs und/oder siRNAs aufgrund der Effizienz von RNAi in P. maidis Zellmembranen durchdringen können 10,13. Dies gilt nicht für die DNAs und/oder Proteine, die in der traditionellen Transgenese oder in der Cas9-basierten Genom-Editierung verwendet werden, die beide eine Vorstufe für die Erzeugung von Insekten wären, die einen Gene Drive tragen. Um eine Genom-Editierung oder andere Formen der Keimbahntransformation zu erreichen, werden diese DNAs und Proteine idealerweise während des synzytialen Blastoderm-Stadiums, bevor der Insektenembryo zellularisiert, in Embryonen mikroinjiziert. Das Timing ist entscheidend, denn das Synzytialstadium ist der früheste Teil der Entwicklung14,15. Da die Weibchen von P. maidis ihre Eier bevorzugt in Pflanzengewebe ablegen, kann die Entnahme ausreichender Mengen präzellulärer Embryonen für Mikroinjektionen arbeitsintensiv und zeitaufwändig sein. Daher wurden neue Techniken entwickelt, um P. maidis-Embryonen vor der Zellularisierung schnell zu sammeln und zu mikroinjizieren.

Protocol

1. Aufzucht von P. maidis Imagines auf Kolonieebene Pflanzen Sie mindestens vier Töpfe Mais pro Woche und Aufzuchtkäfig mit 3-4 Samen pro Topf. Anbau in einer insektenfreien Umgebung. Wenn die Pflanzen ~5 Wochen alt sind, stellen Sie sie in einen 30 cm x 30 cm x 60 cm großen Käfig. Besorgen Sie sich eine ausreichende Menge erwachsener P. maidis (~500) aus einem Forschungslabor oder in freier Wildbahn und setzen Sie sie in einen insektensicheren Käfig mit 9-12 Maispflanzen (3-4 Töpfe). Halten Sie die Kolonie in einem Inkubator für die Insektenaufzucht bei 25 °C (± 1 °C), mit mindestens 70 % Luftfeuchtigkeit und einem Lichtzyklus von 14:10. Um eine alterskalibrierte Kolonie zu erzeugen, entfernen Sie alle anfänglichen erwachsenen Tiere nach vier Tagen Eiablage und lassen Sie die in den Käfig gelegten Embryonen auf natürliche Weise schlüpfen und altern. Bringen Sie 5 Wochen alte P. maidis-Insekten (adulte Tiere) in frische Maispflanzen für die wöchentliche Subkultur, indem Sie sie mit einem Absauger sammeln (Abbildung 1). Lassen Sie die erwachsenen Tiere dann in einen sauberen Käfig mit frischen Maispflanzen entlassen. Um einen stetigen Nachschub an jungen Erwachsenen für Versuchszwecke aufrechtzuerhalten, bereiten Sie jede Woche frische, alterskalibrierte Käfige vor. Gießen Sie die Töpfe in den Käfigen zweimal täglich. Schneiden Sie regelmäßig die Stiele ab, entfernen Sie verrottendes Pflanzenmaterial und ersetzen Sie es bei Bedarf durch frische Maistöpfe.HINWEIS: Bei richtiger Pflege kann eine Kolonie ~5 Wochen dauern (d.h. lange genug, damit die in den Käfig gelegten Embryonen erwachsen werden). 2. Eiablagekammer auf Agarosebasis Stellen Sie Eierauffangschalen (Eiablagemedium) her, indem Sie 1 % w/v Agarose in Wasser in saubere, 100 mm x 15 mm große Petrischalen gießen. Lagern Sie das Eiablagemedium nach dem Erstarren bei 4 °C. Bereiten Sie 10% w/v Saccharoselösung für die Fütterung der erwachsenen Tiere vor. Lagern Sie die Saccharoselösung bis zu einem Monat bei -20 °C. Bauen Sie eine Kammer, um die Erwachsenen zu halten, indem Sie ein Loch in den Boden eines 1-Unzen-Bechers schneiden (siehe Materialtabelle) und ein Sieb für den Luftaustausch über das Loch kleben (Abbildung 2). Schneiden Sie Kunststoff-Paraffinwachsfolie in 5 cm x 5 cm große Quadrate; Legen Sie für jede Tasse 2 Quadrate beiseite. Sammle ~15 1 Woche alte erwachsene Weibchen aus einer alterskalibrierten P. maidis-Kolonie. Um Weibchen auszuwählen, untersuchen Sie die ventrale Seite des Abdomens und suchen Sie nach dem Ovipositor, der typischerweise dunkler ist als der Rest des Abdomens (Abbildung 3). Bewahren Sie erwachsene Tiere bis zu einer Stunde in einer konischen Durchstechflasche mit einem Fassungsvermögen von 15 ml auf, wenn Sie mehrere Eiablagekammern einrichten. Kühlen Sie die Insekten vor dem Geschlecht kurz auf Eis und setzen Sie sie in den erwachsenen Behälter um.HINWEIS: Diese Untersuchung kann ohne Mikroskop durchgeführt werden. Erwachsene Weibchen, die Zeit zum Fressen und zur Paarung hatten, haben in der Regel auch einen größeren Hinterleib als erwachsene Männchen und sind fügsamer. Daher können sie leichter aus einer Käfigpopulation ausgewählt werden. Übertragen Sie die Weibchen in einen Behälter für Erwachsene und versiegeln Sie den Becher mit 1 Schicht Paraffinwachsfolie, indem Sie ihn gleichmäßig auf das 3-4-fache seiner ursprünglichen Größe dehnen (Abbildung 4A, B). Tragen Sie 400 μl 10 % w/v Saccharoselösung auf die Oberseite der Kunststoff-Paraffin-Wachsfilm-Versiegelung auf und fügen Sie eine zweite Schicht Kunststoff-Paraffin-Wachsfolie hinzu, wobei die Kunststoff-Paraffin-Wachsfolie genau wie oben dehnt wird (Abbildung 4C, D).Anmerkungen: Das Sandwich aus gestreckter Kunststoff-Paraffinwachsfolie setzt die Saccharoselösung unter Druck, was für die Fütterung von Erwachsenen sehr wichtig ist, aber die Weibchen nicht daran hindert, ihre Legeapparate bis in das Eiablagemedium zu durchstechen. Legen Sie die adulte Kammer mit der Kunststoff-Paraffinwachsfolie direkt auf das Eiablagemedium auf eine Eierauffangschale und wickeln Sie die gesamte Eiablagekammer mit Frischhaltefolie ein, ohne die Luftlöcher abzudecken, da diese für den Luftaustausch benötigt werden (Abbildung 5). Inkubieren Sie jede Eiablagekammer bei 25 °C mit 70 % Luftfeuchtigkeit und einem Lichtzyklus von 14:10. Wechseln Sie das Sandwich aus Kunststoff-Paraffinwachsfilm und 10% w/v Saccharoselösung täglich und entfernen Sie jegliches Wasser, das sich im Becher ansammelt. 3. Embryonenentnahme und -ausrichtung in einer Umgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit Richten Sie ein stereomikroskopisches Mikroinjektionssystem in einem befeuchteten Raum oder einer Haube (befeuchtete Haube; Abbildung 6) um sicherzustellen, dass die Arbeitsumgebung während des gesamten Mikroinjektionsprozesses eine Luftfeuchtigkeit von mindestens 70 % erreicht. Überprüfen Sie das Eiablagemedium auf Eier nach der gewünschten Eiablagezeit. Tun Sie dies in einer befeuchteten Haube oder einer anderen feuchten Umgebung.HINWEIS: Die normalerweise verwendete Eiablagezeit war über Nacht von 18 Uhr bis 10 Uhr und dauerte ~16 Stunden. Wenn Eier in die Agarose gelegt werden, graben Sie sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette aus und legen Sie sie auf die Oberfläche der Agarose, um sie feucht zu halten (Abbildung 7A). Kleben Sie einen Streifen doppelseitiges Klebeband von 1 mm x 15 mm auf ein Deckglas von 22 mm x 30 mm (Abbildung 7B). Legen Sie das Deckglas mit der Klebebandseite nach oben auf das Eiablagemedium (Abbildung 7C). Nehmen Sie jedes einzelne Ei von der Agaroberfläche auf und bewegen Sie es mit einem feinen Pinsel auf das doppelseitige Klebeband. Entfernen Sie alle Eier, die vollständig weiß sind oder eine schwarze Färbung aufweisen. Gesunde Eier sind halbtransparent. Legen Sie die bananenförmigen Eier auf die Seite, wobei das größere Ende auf das doppelseitige Klebeband geklebt wird (Abbildung 7D).Anmerkungen: Bewahren Sie die Eier immer in einer Umgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit auf, z. B. in einer Petrischale mit einer Schicht von 1% Agar auf dem Boden. 4. Herstellung von CRISPR-Reagenzien und Injektionsnadeln Ziehen Sie Quarznadeln mit einem Mikropipettenabzieher vom Typ Flaming/Brown. Fasen Sie die Quarznadeln mit einer Mikropipetten-Anfasmaschine ab. Verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um gezogene Nadeln in einem durchsichtigen Behälter, z. B. einer Petrischale, zu befestigen, bis sie gebrauchsfertig sind. Bereiten Sie die Injektionslösung vor, indem Sie 0,5 μl Cas9-Protein (5 μg/μl Stammlösung) und 0,5 μl sgRNA (4 μg/μl Stammlösung; siehe Materialtabelle) mit 1 μl Phenolrotpuffer in einem Endvolumen von 5 μl kombinieren. Um Partikel auszufällen, die die Nadel verstopfen könnten, die Lösung kurz vortexen und 3 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. Füllen Sie die Injektionsnadel auf und achten Sie darauf, dass die Injektionsmischung in der Nähe des sich verjüngenden Endes der Nadel belassen wird. Entfernen Sie eventuelle Blasen von der Nadelspitze. Setzen Sie die hinterfüllte Nadel vorsichtig in den Nadelhalter ein und ziehen Sie den Edelstahlkragen fest, um die Nadel während der Mikroinjektion sicher an Ort und Stelle zu halten. Erzeugen Sie einen zuverlässigen Fluss der Injektionslösung aus der Nadel, indem Sie mit einem feinen, angefeuchteten Pinsel sanft über die abgeschrägte Spitze streichen, während Sie mit dem Injektionssystem Luftdruckstöße an die Nadel abgeben.Anmerkungen: Die Nadel ist bereit für die Injektion, wenn die Injektionsmischung die Spitze in kleinen Mengen verlassen kann. 5. Mikroinjektion und Pflege nach der Injektion Bereiten Sie eine Mikroinjektionsplattform vor, indem Sie eine saubere 100 mm x 15 mm große Petrischale mit 1%igem Agar füllen, um eine ebene Agarschicht zu bilden, die bündig mit der Oberseite der Schale abschließt. Legen Sie ein zuvor präpariertes Deckglas mit ~25 Embryonen auf die Agarplattform (Abbildung 8A).Anmerkungen: Alle Injektionsschritte müssen in einer befeuchteten Haube (~70% Luftfeuchtigkeit) durchgeführt werden. Überprüfen Sie den Injektionsdruck, indem Sie die Nadelspitze in einen Tropfen Wasser legen und den Injektionszyklus einleiten.Anmerkungen: Bei korrekter Druckeinstellung sollte sich eine kleine Menge Injektionslösung im Wasser verteilen (Abbildung 8B). Führen Sie die Nadel in das größere Ende des Embryos ein, wobei Sie sich von der linken Seite des Deckglases nähern (Abbildung 8C). Geben Sie die Injektionslösung in das Ei und ziehen Sie die Nadel schnell heraus. Nachdem alle Eier injiziert wurden, legen Sie das Deckglas auf die Oberfläche einer neuen 1%igen Agar-Schale und geben Sie die Schale in eine Feuchtigkeitskammer (Abbildung 9). 6. Inkubation und Schlüpfen von Embryonen Die Schlupfkammer für 6 Tage in einen 25 °C heißen Inkubator stellen. Übertragen Sie alle überlebenden Embryonen mit sauberem Wasser und einem feinen Pinsel in eine 35 mm x 10 mm große Petrischale, deren Boden mit wasserangefeuchtetem Filterpapier bedeckt ist. Versiegeln Sie die Petrischale mit einer Paraffinwachsfolie aus Kunststoff und halten Sie sie bei 25 °C, damit die Embryonen schlüpfen können. Beginnen Sie 6 Tage nach der Injektion mit der Überprüfung der Embryonen auf Überleben.HINWEIS: Die ersten Nymphen im Stadium schlüpfen um Tag 8 herum. Übertragen Sie die Nymphen mit einem feinen Pinsel in eine Petrischale mit Blattresten. Decken Sie die Schüssel ab und versiegeln Sie sie mit Paraffinwachsfolie. Die verschlossene Schale der Jungtiere auf Blattstecklingen 48 h bei 25 °C bebrüten. Alle 2 Tage alten Nymphen aus einer Injektionsrunde mit einer feinen Bürste in einen Aufzuchtkäfig mit Maispflanzen überführen. Wenn Injizierte mit sichtbarem Phänotyp in ausreichender Anzahl wiedergefunden werden, ziehen Sie sie separat auf, um die Erholung des Zielmerkmals in der nächsten Generation zu maximieren. Andernfalls führen Sie eine Massenpaarung aller Injektoren durch.Anmerkungen: Legen Sie die Jungtiere vorsichtig in den Wirtel der Maispflanze, um Zuflucht zu bieten und die richtige Luftfeuchtigkeit in ihrer unmittelbaren Umgebung zu gewährleisten. Ziehen Sie die Insekten unter den oben beschriebenen Bedingungen auf und achten Sie auf die richtige Temperatur, Luftfeuchtigkeit und regelmäßige Umlagerungen auf frische Maispflanzen. Screenen Sie die Nachkommen auf erwartete Phänotypen. Individuen, die den gewünschten Phänotyp aufweisen, werden in ihren eigenen Käfig gesetzt, um homozygote Linien zu etablieren.

Representative Results

Die Eiablagekammer wurde speziell entwickelt, um es den Weibchen von P. maidis zu ermöglichen, sich während der Eiablage in einem schützenden Medium zu ernähren, aus dem ihre Eier leicht geborgen werden können. Mit dieser Methode wurden ausreichende Mengen präzellulärer Embryonen für die Mikroinjektion mit DNA, RNA und/oder Proteinen gewonnen. Ausgewachsene P. maidis-Weibchen legen ihre Eier in der Regel in das Blattgewebe der Maispflanzen, was es zu einer Herausforderung macht, in kurzer Zeit genügend Eier zu bekommen, da viel Blattsektion erforderlich ist . Die künstliche Eiablageumgebung bietet eine Lösung, um diese Probleme zu überwinden. Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, wurden in 4 Wochen 6.483 Eier von insgesamt 645 Weibchen gesammelt. Die Weibchen beginnen in der Regel nach dem 2. Tag mit der Eiablage und liefern die meisten Eier vom 4. bis zum 6. Tag. Die Eiablageaktivität verlangsamte sich an Tag 9. Jede Eiablagekammer wurde am Freitag aufgebaut und von Sonntag bis zum nächsten Sonntag auf Eier untersucht. Die Befolgung dieses Zeitplans ermöglichte es, die meisten Eizellen während der Arbeitswoche für Mikroinjektionen zu sammeln. Die erste praktische Anwendung dieses Eiablagesystems bestand darin, die Wirksamkeit des Cas9-vermittelten Gen-Knockouts zu testen, wobei das P. maidis-Ortholog des Augenfarbengens Weiß (Pmw) als Ziel diente. Es ist bekannt, dass Mutationen in Weiß bei anderen Insektenarten zu einem erheblichen Verlust der Augenpigmentierung führen, und Weiß ist zellautonom, so dass Mutationen bei injizierten Individuen nachgewiesen werden können16,17. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass selbst eine kleine Mutation zu einem Funktionsverlust führen kann, wurden Guide-RNAs so konzipiert, dass sie im Bereich der ATP-bindenden Kassette schneiden, die für die White-Funktion notwendig ist16. P. maidis Embryonen wurden entweder mit 20% Phenolrot (Injektionspuffer), Injektionspuffer mit Cas9 in einer Endkonzentration von 800 ng/μL (Cas9-Kontrolle) oder Cas9 in Injektionspuffer zusammen mit drei Guide-RNAs in einer Konzentration von jeweils 400 ng/μL injiziert. Die Kombination von drei Leitfäden innerhalb einer Injektionsmischung sollte die Chancen auf die Erzeugung von Mutanten weiter maximieren, sowohl durch die Erzeugung einer großen Deletion als auch durch die Kompensation der Möglichkeit, dass eine einzelne Anleitung für das Schneiden unwirksam sein könnte. Die Entwicklungsraten für jede Behandlung waren vergleichbar (Tabelle 2), wobei 50-60% der injizierten Personen Entwicklungszeichen zeigten. Die Schraffurraten für die Puffer- und Cas9-Kontrollen waren ebenfalls vergleichbar; Die Schlupfraten der Individuen, die den Drei-Guide-Mix erhielten, waren jedoch relativ niedriger. Zum jetzigen Zeitpunkt ist unklar, ob das reduzierte Überleben auf den Verlust der Weißfunktion zurückzuführen ist oder auf unbeabsichtigte Folgen des Drei-Leit-Mixes, wie z. B. Off-Target-Effekte (siehe Diskussionsabschnitt). Keines der Individuen mit vollständigem Verlust der Augenpigmentierung (d. h. vollständiger Knockout) schlüpfte jedoch, und keiner der Nachkommen der injizierten Individuen hatte weiße Augen. Die On-Target-Wirksamkeit der Cas9-basierten Mutagenese wurde auf zwei Arten verifiziert. Zuerst wurden die Injizierten auf den Verlust der Augenpigmentierung untersucht. Von den 71 Individuen, die sich entwickelten, zeigten 23 einen gewissen Grad an Pigmentverlust (Abbildung 10), und 9 dieser Individuen schlüpften, was zu einer Knockout-Rate von ≥32 % führte. Bei beiden Kontrollbehandlungen wurde kein Verlust der Augenpigmente beobachtet. Zweitens wurden chromosomale Mutationen mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR)18 und Sequenzierung19 bestätigt. Da eine mutierte Linie nicht gefunden werden konnte, wurde genomische DNA aus Pools von Embryonen analysiert, die entweder mit der Drei-Guide-Mischung oder dem Puffer injiziert wurden. Es wird erwartet, dass die Drei-Leit-Mischung ~180 Basenpaare aus dem weißen Locus entfernt. Dies zeigt sich in den PCR-Produkten, die aus genomischer DNA amplifiziert wurden, die aus injizierten Individuen isoliert wurde, sowie an den zugehörigen Sequenzdaten, die aus diesen Produkten generiert wurden (Abbildung 11). Diese kombinierten Beweise deuten darauf hin, dass Embryonen injiziert wurden, bevor die Zellularisierung stattfand. Abbildung 1: Aspirator. Ein effektiver Absauger kann durch den Anschluss einer Vakuumpumpe am Einlass über einen Kunststoffschlauch an einen konischen 15-ml-Kunststoffschlauch montiert werden. Etwa 0,5 cm sollten vorsichtig vom Boden des konischen Rohrs entfernt werden. Ein Wattebausch sollte in das konische Röhrchen über der Öffnung des Plastikschlauchs gelegt werden, um erwachsene P. maidis beim Sammeln aufzufangen und von der Vakuumpumpe fernzuhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Bau von Behältern für Erwachsene. (A) Die benötigten Vorräte (im Uhrzeigersinn von oben links): Bildschirm, Heißklebepistole, Rasierklinge, 1-Unzen-Behälter. (B) Ein großes Loch sollte in den Boden des 1-Unzen-Behälters geschnitten werden, und ein Quadrat des Siebs wird gerade groß genug geschnitten, um dieses Loch abzudecken. (C) Das Sieb wird dann mit Heißkleber über das Loch geklebt. (D) Sobald der Kleber ausgehärtet ist, sollte überschüssiges Netz entfernt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Geschlechtsbestimmung der adulten P. maidis. Die ventralen Seiten der männlichen (links) und weiblichen (rechts) adulten P. maidis sind dargestellt. Der Ovipositor, der über dem weiblichen Hinterleib sichtbar ist, ist der deutlichste Indikator für das Geschlecht eines Individuums. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Versiegelung von Erwachsenen in Behältern . (A) Ein 5 cm x 5 cm großes Quadrat aus Paraffinwachsfolie aus Kunststoff. (B) Die Folie sollte gleichmäßig auf das 3-4-fache ihrer ursprünglichen Größe gedehnt werden. (C) Sobald die Erwachsenen in den Behälter für Erwachsene gelegt wurden, sollte die gespannte Folie über die Öffnung gelegt werden, um die Erwachsenen zu sichern. Anschließend sollte ein 400-μl-Tropfen 10%iger w/v-Saccharoselösung auf die Folie aufgetragen werden. (D) Um einen ausreichenden Fütterungsdruck für die erwachsenen Tiere zu gewährleisten, sollte ein zweites 5 cm x 5 cm großes Quadrat aus Paraffinfolie in ähnlicher Weise gespannt und über den Saccharosetropfen gelegt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 5: Einrichten einer Eiablagekammer. (A) Die benötigten Vorräte (im Uhrzeigersinn von oben links): Plastikfolie, ein fertiger Behälter für erwachsene Tiere (mit erwachsenen Behältern) und eine Petrischale mit 1 % Agarose (Eiablagemedium). (B) Das Behältnis für erwachsene Tiere sollte auf die Agarose gestellt werden, wobei die Kunststoff-Paraffinfolie/das 10%ige Saccharose-“Sandwich” direkt auf das Eiablagemedium gelegt wird. (C) Plastikfolie wird verwendet, um den Behälter für erwachsene Tiere am Eiablagemedium zu befestigen. Dadurch wird verhindert, dass das Medium zu schnell austrocknet. (D) Es sollte darauf geachtet werden, dass das Sieb des Behälters für Erwachsene nicht abgedeckt wird, damit der Luftaustausch fortgesetzt werden kann. (E) Schematische Darstellung der Eiablagekammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 6: Befeuchtete Haube. Um das Injektionszielfernrohr herum wurde eine mit einem Luftbefeuchter ausgestattete Haube angebracht, um Zugluft zu minimieren und die Luftfeuchtigkeit während der Handhabung der Embryonen aufrechtzuerhalten. Klappen können über den Eingang geklappt werden, nachdem der Arbeiter an Ort und Stelle ist, um die Aufrechterhaltung der richtigen Luftfeuchtigkeit zu unterstützen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 7: Entnahme von Embryonen zur Vorbereitung auf Injektionen . (A) Embryonen, die im Eiablagemedium abgelegt wurden. Mit einer feinen Pinzette werden Embryonen aus dem Medium entnommen und auf dessen Oberfläche platziert. (B) Ein schmaler Streifen aus doppelseitigem Klebeband von 1 mm x 15 mm auf einem Deckglas von 22 mm x 30 mm. (C) Das Deckglas kann auf das Eiablagemedium gelegt werden, um den Transfer der Embryonen von der Oberfläche des Mediums auf das Klebeband auf dem Deckglas zu erleichtern. (D) Die Embryonen von P. maidis sind bananenförmig, wobei ein Ende schmaler ist als das andere (schmales Ende mit roter Pfeilspitze angedeutet; breiteres Ende mit gelber Pfeilspitze im Beispielembryo angedeutet). Das breite Ende des Embryos sollte auf das Tape gelegt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 8: Injektion . (A) Die Injektionsplattform ist eine Petrischale, die bis zum Rand mit 1%igem Agar gefüllt ist. Das Deckglas mit einem Klebebandstreifen, der die Embryonen enthält, sollte direkt auf die Oberfläche der Injektionsplattform gelegt werden. (B) Der Injektionsdruck sollte vor der Injektion von Embryonen getestet werden, indem eine kleine Menge Injektionslösung in einen Tropfen Wasser “injiziert” wird. Diese Methode kann auch jederzeit während des Injektionsvorgangs angewendet werden, um die Nadel auf Verstopfungen zu überprüfen. (C) Embryonen sollten injiziert werden, indem die Nadel in das größere Ende des Embryos eingeführt wird. Die Injektionslösung sollte sichtbar sein, wenn die Injektion erfolgreich war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 9: Pflege nach der Injektion . (A) Sobald alle Embryonen auf einem Deckglas injiziert wurden, sollte das Deckglas in eine frische Petrischale mit 1 % Agarose gelegt werden. (B) Die Petrischale mit dem Deckglas kann dann in einer Feuchtigkeitskammer (wie der gezeigten) aufbewahrt werden, bis die Embryonen schlüpfen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 10: Pmw-Knockout-Phänotyp. (A) Altersangepasste Kontroll- und (B) Pmw-Knockout-Embryonen mit sich entwickelnden Augen, die durch schwarze Pfeilspitzen gekennzeichnet sind. Der Embryo in B ist ein Mosaik, wie ein kleiner Streifen der Pigmentierung zu sehen ist. (C) Altersangepasste Kontroll- und (D) Pmw-Knockout-Jungtiere , wobei die Einschübe einen anderen Winkel auf den Augen zeigen. Das Jungtier in D ist ebenfalls ein Mosaik. Ein weißer Pfeil zeigt auf einen Bereich im Hauptbild, der den Pigmentverlust zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 11: Pmw-Knockout-Sequenz . (A) Maßstabsgetreues Modell der Pmw-mRNA , markiert in 500-bp-Schritten, mit Angabe der Positionen der gRNA-Bindungsstellen: G1, blau; G2, gelb; G3, rosa. Alle Frame-Shift-Mutationen, die an diesem Punkt generiert werden, stören den Großteil des Übersetzungsprodukts. (B) Genomischer Kontext von gRNA-Stellen, alle in einem Exon (fett geschriebener Text). Hilfsbindungsstellen werden in den gleichen Farben wie A hervorgehoben und PAMs unterstrichen. Die Spanne beträgt ~300 bp. Die In-Frame-Übersetzung des Exons ist oben als einbuchstabige Abkürzungen in Großbuchstaben dargestellt. Markiert sind zwei Motive, die spezifisch für Augenpigmenttransporter sind. Das CDEPT-Motiv der funktionellen Walker-B-Domäne ist violett und das IHQP-Motiv der H-Schleifendomäne grün eingerahmt. Beide Domänen sind für die Funktion des ATP-Transporters von entscheidender Bedeutung. (C) Die Pmw-Zielregion wurde mittels zweier PCR-Runden amplifiziert. Das Produkt der zweiten Runde wurde an einem Gel auf Anzeichen einer Größenverschiebung untersucht, die auf die erfolgreiche Entfernung des Bereichs zwischen den Führungen zurückzuführen ist. Bahnen: L = 100 bp Leiter; 1 = PCR-Wasserkontrolle; 2 = Eingespeiste Eizellen puffern; 3-4 = zwei separate Sätze von Eiern, die mit einer Drei-Führungsmischung injiziert werden. Nur Embryonen, die die Drei-Guide-Mischung erhielten, produzierten sowohl die WT-Bande (roter Pfeil) als auch die Bande, die aus einer vollständigen Exzision resultierte (weißer Pfeil). (D) Um die Identität der unteren (weißer Pfeil) Bande zu bestätigen, wurde diese DNA gereinigt, kloniert und sequenziert. Die oberste Zeile ist die Wildtyp-Sequenz. Die anderen beiden Zeilen sind Sequenzen von zwei Klonen. Drei weitere Klone stimmten mit der unteren Sequenz überein. Die blaue Hervorhebung zeigt die Bindungsstelle von Guide 1 an, während die rosa Hervorhebung die Bindungsstelle von Guide 3 anzeigt. In beiden Allelen wurde die gesamte Region zwischen diesen beiden Leitstellen gelöscht. Abkürzungen: Pmw = Peregrinus maidis weißes Gen; gRNA = Leit-RNA; PAM = Protospacer-benachbartes Motiv; ATP = Adenosintriphosphat; PCR = Polymerase-Kettenreaktion; WT = Wildtyp; KO = K.O. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Garnitur # Anzahl der Tassen # der Weibchen in jedem Becher # von Eiern Gesamt # Eier Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7 Tag 8 Tag 9 1 10 15 0 26 166 355 530 193 91 37 1398 2 15 15 22 238 489 699 520 379 203 58 2608 3 8 15 0 57 230 190 116 80 34 1 708 4 10 15 0 226 446 519 301 179 24 15 1710 Gesamt 43 15 23 547 1331 1763 1467 831 352 111 6483 Tabelle 1: Repräsentative Eisammlungen aus der Umgebung der künstlichen Eiablage. Es werden Daten aus vier Sätzen von Eiersammelbechern angezeigt, wobei die Eierzählung am zweiten Tag nach dem Einrichten beginnt und bis zum neunten Tag läuft. Injektionsbehandlung Gesamt injiziert Gesamt entwickelt Gesamt schraffiert Entwicklungsrate (%) Schlupfrate (%) Puffer 39 20 12 51 31 Cas9 39 24 14 61 36 Cas9 +Pmw gRNAs 121 71 28 59 28 Tabelle 2: Überlebens- und Knockout-Raten aus Injektionen von 3 verschiedenen Injektionsmischungen.

Discussion

Eiablagequalität und Nährwert
Kürzlich haben Forscher, die mit einer verwandten Art, Nilaparvata lugens, arbeiten, die Eier, die sie für Mikroinjektionen verwendeten, direkt aus dem Blatt gewonnen und die injizierten Eier im Blattgewebe behalten, bis sie geschlüpftsind 17. Diese blattbasierte Methode bot zwar eine natürlichere Umgebung für die Embryonalentwicklung, erhöhte aber auch die Wahrscheinlichkeit von Infektionen und Eischäden während des Entnahmeprozesses. Das hier vorgestellte künstliche Eiablagesystem sorgt für eine gleichmäßigere Umgebung und verringert die Wahrscheinlichkeit, dass die Eier durch die Handhabung beschädigt werden. Durch das Aufstellen der Eiablagebecher am Freitag wurde der Großteil der eiförmigen Eizellen während einer typischen Arbeitswoche gesammelt, was denjenigen zugute kam, die die Mikroinjektionsarbeit durchführten. Ein Vorbehalt bei dieser Methode ist jedoch, dass der Mangel an Nährstoffen in der 10%igen Saccharoselösungsdiät schließlich die Gesundheit der Insekten beeinträchtigt und die Weibchen in den Bechern normalerweise nach nur 10 Tagen absterben. Auch die Qualität der Eier beginnt nach 6 Tagen nachzulassen, was sich in einer Zunahme toter oder ungesund aussehender Eier zeigt. Daher ist es wichtig, die Eier, die für Mikroinjektionen verwendet werden, selektiv auszuwählen und die Weibchen nach dem 6. Tag nicht mehr zu behalten.

Überlebensrate und Luftfeuchtigkeit
Zwei Faktoren scheinen für das embryonale Überleben durch den Mikroinjektionsprozess entscheidend zu sein. Die größte Herausforderung beim Umgang mit P. maidis-Embryonen besteht darin, zu verhindern, dass sie nach der Entnahme aus dem Eiablagemedium und während der Mikroinjektion austrocknen. Da die Eier in der Regel im Pflanzengewebe abgelegt werden, fehlt ihnen eine ausreichende Schale, um eine Austrocknung zu verhindern. Selbst in der befeuchteten Haube gingen ganze Eier durch Austrocknung verloren. Aber auch eine zu hohe Luftfeuchtigkeit könnte die Mikroinjektionen beeinträchtigen, wenn sich Wasser auf dem doppelseitigen Klebeband oder auf dem Endoskop ansammelt. Leider war die Dehydrierung der Eizellen während des Mikroinjektionsprozesses in der Regel nicht leicht zu erkennen, und sie erschienen häufig normal, bis sie 2 oder 3 Tage später vollständig transparent wurden und keine Anzeichen von Entwicklung zeigten.

Auch die Qualität der Nadeln scheint eine wichtige Rolle für das Überleben zu spielen. Die Nadel sollte abgeschrägt werden, um unnötige Schäden am Ei zu minimieren. Wenn die Nadel blockiert ist, wird die Nadel in der Regel wieder in einen funktionsfähigen Zustand versetzt, indem die Clearing-Funktion am Injektor verwendet wird, während die Nadelspitze mit einem angefeuchteten Pinsel sanft gestreicht wird (siehe Schritt 4.7). Unabhängig davon wird empfohlen, nur winzige Mengen der Injektionslösung (~0,25 μL) in jede Nadel zu geben und alle paar Objektträger (~50-60 Eier) auf eine neue Nadel umzusteigen, um sicherzustellen, dass die Nadelqualität während des gesamten Injektionsvorgangs erhalten bleibt.

Erfolgreiche Generierung eines Knockout-Phänotyps
Um die Keimzellen erfolgreich zu transformieren, müssen die Mikroinjektionen des Embryos in der Regel so früh wie möglich vor der Zellularisierung erfolgen. Je nach Insektenart reicht das Zeitfenster für die Durchführung der Mikroinjektionen von nur wenigen Stunden bis zu einem ganzen Tag14,15,20. Es ist noch unklar, wann P. maidis-Embryonen zellularisiert werden. Der Cas9-vermittelte Knockout wurde an Embryonen im Alter von 4 h nach der Eiablage (pel) bis zu 16 h pel getestet, und die erwarteten Phänotypen wurden in allen Experimenten beobachtet, was darauf hindeutet, dass alle Mikroinjektionen innerhalb des Vorzellurisierungsfensters durchgeführt wurden.

Das P. maidis-Ortholog des Augenfarbengens, weiß, wurde ausgewählt, weil man davon ausging, dass der Knockout-Phänotyp aufgrund seiner zellautonomen Natur bei injizierten Patienten leicht zu screenen ist. Wie erwartet, waren sowohl Mosaik- als auch Total-Knockouts bei den Embryonen, die die Injektionsmischung erhielten, die Cas9- und Guide-RNAs enthielt, eindeutig identifizierbar. Leider schlüpften keine Injizierten mit vollständigem Knockout, und eine Massenpaarung überlebender Injektoren brachte keine weißäugigen Nachkommen hervor. Später wurde jedoch erfolgreich eine mutierte Linie generiert, indem ein anderes Gen angegriffen wurde (Klobasa et al., in Arbeit). Dies würde darauf hindeuten, dass das Scheitern der Etablierung einer weißen Mutantenlinie höchstwahrscheinlich entweder auf Off-Target-Effekte (d.h. Cas9, das wichtige Regionen an anderer Stelle im Genom schneidet) zurückzuführen ist, die eine eng miteinander verbundene letale Mutation erzeugen, oder auf eine unvorhergesehene kritische Rolle von Weiß de P. maidis.

Phänotypische und molekulare Daten (Abbildung 8 und Abbildung 9) bestätigen, dass in einer Stichprobe injizierter Embryonen ein signifikanter Knockout im weißen Locus entstanden ist, der zu einem vollständigen Verlust der Genfunktion führen würde. Während Mutationen in Weiß bei einigen Arten lebensfähig sind, gibt es einen Präzedenzfall dafür, dass eine reduzierte weiße Aktivität nachteilig ist21,22. Off-Target-Effekte können jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden. Die Vorhersage wahrscheinlicher Off-Targets erfordert genaue Genomsequenzdaten23, was der aktuelle Stand der genomischen Ressourcen in P. maidis derzeit unmöglich macht. Unabhängig davon können mit diesen neuen Methoden andere Zielgene sicher getestet werden, sogar in Richtung traditionellerer Transgenese, um diesem schädlichen Schädling neue genetische Werkzeuge zur Verfügung zu stellen.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die North Carolina State University, Abteilung für Entomologie und Pflanzenpathologie, ist Teil eines Teams, das das Insect Allies Program der DARPA unterstützt. Die geäußerten Ansichten, Meinungen und/oder Erkenntnisse sind die der Autoren und sollten nicht so interpretiert werden, dass sie die offiziellen Ansichten oder Richtlinien des Verteidigungsministeriums oder der US-Regierung darstellen. Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte. MDL, DR und AEW konzipierten das Projekt und stellten die Finanzierungsakquise, die Projektverwaltung und die Ressourcen zur Verfügung. FC, WK, NG und MDL konzipierten und gestalteten die Mikroinjektionsexperimente; OH konzipierte und entwarf die Eiablagemethode. FC und WK führten die Experimente durch; FC und WK analysierten die Ergebnisse; und FC, WK, NG und MDL schrieben das Manuskript. Die Autoren bedanken sich besonders bei Kyle Sozanski und Victoria Barnett für ihre Hilfe bei der Erhaltung der P. maidis-Kolonien.

Materials

1 oz Containers Dart P100N Adult container for egg-laying setup
15 mL Conical Tubes Olympus Genesee 28-103 Serves as collection tube on vacuum aspirator setup
15 mL Conical Tubes Olympus Genesee 28-106 For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening
Aspirator Bioquip 1135A For handling planthoppers
Vacuum Aspirator Fischer Technical LAV-3 Vacuum for aspirating larger numbers of insects
Blue Spectrum LED Lights Home Depot GLP24FS/19W/LED Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on
Cas9 TrueCut Cas9 Protein v2 A36498 Endonuclease for cutting planthopper genes
Clear Vinyl Tubing Home Depot 3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft. Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup
Corn planthoppers North Carolina State University N/A Request from Dr. Anna Whitfield's lab
Cotton balls Genessee 51-101 Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup
Double sided tape Scotch Double Sided Tape NA Holding eggs for microinjection
Early Sunglow corn Park Seed Company 05093-PK-N Corn for rearing planthoppers
epTIPS Microloader Tips Eppendorf C2554691 Backfilling needle loading tips
Femtojet Microinjection System Eppendorf 5247 Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size)
Nutri-Fly Drosophila Agar Genessee 66-103 Substrate for everything except egg-laying dish
Fine forceps Bioquip 4731 Egg handling
General Purpose LE Agarose Apex 20-102 Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium)
Guide RNA 1 – GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG Synthego CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) RNA guides for targeting planthopper white gene
Guide RNA 2 – UCUGAAAUCACUGGCCAAUA Synthego CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) RNA guides for targeting planthopper white gene
Guide RNA 3 – GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU Synthego CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) RNA guides for targeting planthopper white gene
Humidifyer Homedics UHE-CM45 For providing humidity in humidified hood
Humidity chamber Billups-Rothenberg MIC-101 For holding injected embryos until hatching
Insect rearing cages Bioquip (special order) Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides) Cage for planthoppers on corn
Laser-based Micropipiette Puller Sutter Instruments P-2000/G For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope Leica M165 FC Planthopper screening
Microinjection Scope Leica MZ12-5 Microinjection scope outfited with an XY stage
Micromanipulator Narishige MN-151 For positioning microinjection needle
Micropipette beveler Sutter Instruments FG-BV10-D For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle
Microscope Stage AmScope GT100 X-Y Gliding Table For positioning and moving embryos under microscope
Miniature Paint Brush Testor #2 8733 Sold in 3 pack 281206 Fine paintbrushes for embryo handling
Needle Holder Narishige HI-7 For holding the microinjection needle
Percival Incubator Percival I41VLH3C8 Rearing injectees until hatch
Petri Dishes (100 x 15 mm) VWR 89038-968 Making agar dish for egg-lay
pGEM-T Easy Vector System I cloning kit Promega A1360 Cloning Pm white target site
Phenol Red Sigma 143-78-8 Microinjection buffer
Plain Microscope Slides or coverslip Fisher Scientific 12-549-3 Hold eggs for microinjection
Plasmid DNA Midi Kit Zymo D4200 Purification of injection-ready plasmid DNAs
Plastic paraffin film Pechiney Plastic Packaging PM-996 Roll size 4 in. x 125 ft
Plastic wrap Glad ClingWrap Plastic Wrap NA Wrap the entire egg-laying chamber
Primer – PmW CRISPR check F1 – AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA IDT 25 nmole DNA Oligo First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Primer – PmW CRISPR check R1 – GATTCCTCGCTGTTGGGT IDT 25 nmole DNA Oligo First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Primer – PmW CRISPR check F3 – TCACAGACCCTGGTGCTAATC IDT 25 nmole DNA Oligo Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Primer – PmW CRISPR check R3 – GTCCACAATCCACACTTCTGA IDT 25 nmole DNA Oligo Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Quartz capillaries Sutter Instruments QF100-50-10 For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length
Screen (White Organza Fabric) Joann Fabrics 16023889 For covering the adult container
Sparkleen Fisher Scientific 04-320-4 Wash dishes
Sucrose Fisher Scientific BP220-1 To make 10% sucorose solution
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Referencias

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Klobasa, W., Chu, F., Huot, O., Grubbs, N., Rotenberg, D., Whitfield, A. E., Lorenzen, M. D. Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing. J. Vis. Exp. (169), e62417, doi:10.3791/62417 (2021).
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