以下是收集和微注射细胞前玉米飞虱胚胎的方案,目的是通过基于CRISPR / Cas9的基因组编辑修改其基因组或通过种系转化添加标记的转座元件。
玉米飞虱,Peregrinus maidis,是玉米的害虫,也是几种玉米病毒的载体。以前发表的方法描述了通过将双链RNA(dsRNA)显微注射到若虫和成虫中来触发少女假单胞菌中的RNA干扰(RNAi)。尽管RNAi具有强大的功能,但通过该技术产生的表型是短暂的,缺乏长期孟德尔遗传。因此,需要扩大少女假单胞菌工具箱,以包括功能性基因组工具,这些工具将能够产生稳定的突变菌株,为研究人员打开大门,为这种经济上重要的害虫带来新的控制方法。然而,与用于RNAi的dsRNA不同,基于CRISPR / Cas9的基因组编辑和种系转化中使用的组件不容易穿过细胞膜。因此,质粒DNA、RNA和/或蛋白质必须在胚胎细胞化之前显微注射到胚胎中,这使得注射时间成为成功的关键因素。为此,开发了一种基于琼脂糖的产卵方法,以允许以相对较短的间隔从P. maidis雌性中收获胚胎。本文提供了收集和显微注射具有CRISPR成分(已与引导RNA复合的Cas9核酸酶)的细胞前少女假单胞菌胚胎的详细方案,并介绍了基于Cas9的少女假单胞菌眼睛颜色基因白色基因敲除的结果。尽管这些协议描述了少女假单胞菌的CRISPR / Cas9基因组编辑,但它们也可用于通过简单地改变注射溶液的组成,通过种系转化来生产转基因少女假单胞菌。
玉米飞虱,Peregrinus maidis,是玉米1,2,3的经济重要害虫。它们对植物造成直接的物理损害,无论是在用刺穿吸口器进食时,还是在繁殖过程中,当它们将胚胎直接放入植物组织中时2,4。尽管对作物的直接损害有多种途径,但这些昆虫对作物健康的最大影响是间接的,因为它充当玉米花叶病毒(MMV)和玉米条纹病毒5,6的载体。MMV能够在其P. maidis载体的体内复制,使病毒在其整个生命中持续存在于单个昆虫中,因此它们可以继续将病毒传播给新的宿主植物7,8。控制麦迪假单胞菌及其载体病毒的最常见方法是杀虫剂。
不幸的是,这些产品管理不善导致目标害虫产生抗药性以及污染环境9。因此,需要新的策略来减少这种昆虫/病毒-害虫组合造成的作物损失。先前的工作表明,RNA干扰(RNAi)可能是少女假单胞菌的有效控制方法,因为即使在摄入双链RNA(dsRNA)时,它们也容易受到基因表达下调的影响10。然而,在田间管理dsRNA的最有效方法是通过昆虫赖以生存的植物;因此,作物仍然容易受到昆虫已经携带的任何病毒的影响。随着CRISPR / Cas9基因组编辑的出现,新的害虫控制策略成为可能,包括基于Cas9的基因驱动11,12,可用于减少害虫种群的规模,或用对病毒载体具有抗性的个体取代所述种群。
然而,任何类型的基因驱动系统的开发和部署都需要开发转基因技术。这些方法对于在少女假单胞菌中进行RNAi实验不是必需的,因为由于少女假单胞菌10,13中RNAi的效率,假定dsRNA和/或siRNA能够穿过细胞膜。对于传统转基因或基于Cas9的基因编辑中使用的DNA和/或蛋白质来说,情况并非如此,其中任何一个都是产生携带基因驱动的昆虫的前兆。为了完成基因编辑或其他形式的种系转化,理想情况下,这些DNA和蛋白质在合胞胚层阶段,在昆虫胚胎细胞化之前,被显微注射到胚胎中。时机至关重要,因为合胞阶段是发育的最早部分14,15。由于雌性假单胞菌优先产卵在植物组织中,因此提取足够数量的细胞前胚胎进行显微注射可能是劳动密集型和耗时的。因此,开发了新技术,以便在细胞化之前快速收集和微注射少女假单胞菌胚胎。
蛋蛋质量和营养
最近,研究人员与相关物种 Nilaparvata lugens合作,直接从叶子上获得了他们用于显微注射的卵,将注射的卵保持在叶组织中,直到它们孵化17。虽然这种基于叶子的方法为胚胎发育提供了更自然的环境,但它也增加了在去除过程中感染和卵子损伤的机会。这里介绍的人工产卵系统提供了更均匀的环境,并减少了处理对鸡蛋造成损坏的机会。通过在周五设置产卵杯,大部分产卵卵是在典型的工作周内收集的,这对那些进行显微注射工作的人有益。然而,这种方法的一个警告是,10%蔗糖溶液饮食中缺乏营养最终会影响昆虫的健康,杯中的雌性通常在10天后开始死亡。6天后,卵子质量也开始下降,死亡或不健康的鸡蛋增加就是证明。因此,重要的是要选择用于显微注射的卵子,并且在第 6 天后不要保留雌性。
存活率和湿度
通过显微注射过程,有两个因素似乎对胚胎存活至关重要。处理 少女假单胞菌 胚胎最具挑战性的方面是防止它们从产卵培养基中取出后和整个显微注射过程中干燥。由于卵通常产在植物组织内,因此它们缺乏足够的外壳来防止脱水。即使在加湿的引擎盖中,整套鸡蛋也因干燥而丢失。但是,如果水积聚在双面胶带或示波器上,过高的湿度也会影响显微注射。不幸的是,在显微注射过程中,卵子脱水通常不容易注意到,它们经常看起来正常,直到 2 或 3 天后,当它们变得完全透明时,没有发育的迹象。
针头质量似乎在生存中也起着重要作用。针头应斜面,以尽量减少对鸡蛋的不必要损坏。当针头被堵塞时,使用注射器上的清除功能,同时用蘸湿的画笔轻轻抚摸针尖(见步骤4.7)通常会使针头恢复到功能状态。无论如何,建议仅将微量的注射溶液(~0.25 μL)放入每个针头中,并每隔几张玻片(~50-60个鸡蛋)切换到新针头,以确保在整个注射过程中保持针头质量。
成功生成敲除表型
为了成功转化生殖细胞,胚胎显微注射通常必须在细胞化之前尽早进行。根据昆虫种类的不同,完成显微注射的时间窗口从几个小时到一整天不等14,15,20。目前尚不清楚少女假单胞菌胚胎何时进行细胞化。在产卵后4小时(pel)至16小时胚胎上测试Cas9介导的敲除,并在所有实验中观察到预期的表型,表明所有显微注射均在细胞前窗口内进行。
选择眼睛颜色基因白色的少女假单胞菌直系同源物,因为由于其细胞自主性,预计敲除表型易于在注射者中筛选。事实上,正如预期的那样,在接受含有Cas9和引导RNA的注射混合物的胚胎中,马赛克和总敲除都是清晰可辨的。不幸的是,没有完全敲除的注射者孵化出来,幸存的注射者的大规模交配未能产生白眼后代。然而,后来通过靶向不同的基因成功产生了突变系(Klobasa等人,正在进行中)。这表明未能建立白色突变系很可能是由于脱靶效应(即Cas9切割基因组中其他地方的重要区域)产生紧密相连的致命突变,或者由于白色在P. maidis中不可预测的关键作用。
表型和分子数据(图8和图9)证实,在注射胚胎样本中产生了白色基因座的显着敲除,这将导致基因功能完全丧失。此外,虽然白色突变在某些物种中是可行的,但有先例表明白色活性降低是有害的21,22。也就是说,不能完全排除脱靶效应。预测可能的脱靶需要准确的基因组序列数据23,而P. maidis基因组资源的当前状态使得目前无法做到这一点。无论如何,通过这些新方法,可以自信地测试其他靶基因,甚至可以转向更传统的转基因,为这种有害害虫带来新的遗传工具。
The authors have nothing to disclose.
北卡罗来纳州立大学昆虫学和植物病理学系是支持DARPA昆虫盟友计划的团队的一员。所表达的观点、意见和/或发现是作者的观点、意见和/或发现,不应被解释为代表国防部或美国政府的官方观点或政策。作者声明没有竞争利益。MDL、DR 和 AEW 构思了该项目,并提供了资金获取、项目管理和资源。FC,WK,NG和MDL构思和设计了显微注射实验;OH构思并设计了产蛋方法。FC和WK进行了实验;FC和WK分析了结果;FC、WK、NG 和 MDL 撰写了手稿。作者要特别感谢Kyle Sozanski和Victoria Barnett在维持 P. maidis 殖民地方面的帮助。
1 oz Containers | Dart | P100N | Adult container for egg-laying setup |
15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-103 | Serves as collection tube on vacuum aspirator setup |
15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-106 | For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening |
Aspirator | Bioquip | 1135A | For handling planthoppers |
Vacuum Aspirator | Fischer Technical | LAV-3 | Vacuum for aspirating larger numbers of insects |
Blue Spectrum LED Lights | Home Depot | GLP24FS/19W/LED | Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on |
Cas9 | TrueCut Cas9 Protein v2 | A36498 | Endonuclease for cutting planthopper genes |
Clear Vinyl Tubing | Home Depot | 3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft. | Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup |
Corn planthoppers | North Carolina State University | N/A | Request from Dr. Anna Whitfield's lab |
Cotton balls | Genessee | 51-101 | Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup |
Double sided tape | Scotch Double Sided Tape | NA | Holding eggs for microinjection |
Early Sunglow corn | Park Seed Company | 05093-PK-N | Corn for rearing planthoppers |
epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
Femtojet Microinjection System | Eppendorf | 5247 | Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size) |
Nutri-Fly Drosophila Agar | Genessee | 66-103 | Substrate for everything except egg-laying dish |
Fine forceps | Bioquip | 4731 | Egg handling |
General Purpose LE Agarose | Apex | 20-102 | Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium) |
Guide RNA 1 – GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Guide RNA 2 – UCUGAAAUCACUGGCCAAUA | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Guide RNA 3 – GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Humidifyer | Homedics | UHE-CM45 | For providing humidity in humidified hood |
Humidity chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | For holding injected embryos until hatching |
Insect rearing cages | Bioquip (special order) | Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides) | Cage for planthoppers on corn |
Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160 |
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | Planthopper screening |
Microinjection Scope | Leica | MZ12-5 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
Micromanipulator | Narishige | MN-151 | For positioning microinjection needle |
Micropipette beveler | Sutter Instruments | FG-BV10-D | For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle |
Microscope Stage | AmScope | GT100 X-Y Gliding Table | For positioning and moving embryos under microscope |
Miniature Paint Brush | Testor #2 8733 | Sold in 3 pack 281206 | Fine paintbrushes for embryo handling |
Needle Holder | Narishige | HI-7 | For holding the microinjection needle |
Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | Rearing injectees until hatch |
Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay |
pGEM-T Easy Vector System I cloning kit | Promega | A1360 | Cloning Pm white target site |
Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
Plain Microscope Slides or coverslip | Fisher Scientific | 12-549-3 | Hold eggs for microinjection |
Plasmid DNA Midi Kit | Zymo | D4200 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Roll size 4 in. x 125 ft |
Plastic wrap | Glad ClingWrap Plastic Wrap | NA | Wrap the entire egg-laying chamber |
Primer – PmW CRISPR check F1 – AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check R1 – GATTCCTCGCTGTTGGGT | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check F3 – TCACAGACCCTGGTGCTAATC | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check R3 – GTCCACAATCCACACTTCTGA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Quartz capillaries | Sutter Instruments | QF100-50-10 | For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length |
Screen (White Organza Fabric) | Joann Fabrics | 16023889 | For covering the adult container |
Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | To make 10% sucorose solution |