組織と尿からのヒト腎臓結管状突起の生成

注:本明細書に記載された実験は、エラスムス医療センター(オランダロッテルダム)とマキシマ小児腫瘍学センター(オランダ、ユトレヒト)の医療倫理委員会によって承認されました。 1. 組織からのヒト腎臓結管状の生成 料 プレウォームマルチウェル組織培養プレート(6、12および24ウェル)を一晩で37°Cで行う。 基礎培地(AdDF+++)を1x L-アラニン/L-グルタミンサプリメント、1%w/v 4-(2-ヒドロキセチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES、10 mM)、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質を高度DMEM/F12に加えて調製します。 1.57サプリメントを添加することにより培養培地を調製し、10%R-スポンディンコンディション培地、 表皮成長因子(50 ng/mL)、線維芽細胞増殖因子-10(100 ng/mL)、N-アセチルシステイン(1.25mM)、ローキナーゼ阻害剤Y-27632(10μM)、広域抗生物質(0.1mg/mL)、A83-01(5μM)からAdDF++++++++ 使用前に37°Cまで温める。 4°Cでアリコートを一晩解凍して、元素膜抽出物(BME)を調製する。 手順中にBMEを氷の上に置いてください。 コラゲターゼをAdDF+++で1mg/mLの最終濃度に希釈し、10 μM Y-27632を加えてコラゲターゼ溶液を調製します。37°Cまで温める。 10センチペトリ料理、メス、ピンセットを用意します。紫外線ランプを20分間塗布し、消毒剤、デミ水、70%のv/vエタノールで洗浄を行い、調理器具を消毒します。調理器具を空気乾燥させます。 水平シェーカーを37°Cに予熱する。 プロシージャ AdDF+++培地の30-40 mLで満たされた50 mLの管の腎臓組織を集める。10cmのペトリ皿に、培地の1mL程度に組織片を入れます。メスを使用して、組織を約1mm3サイズにミンチします(図1A)。 鉗子およびメスを使用して15 mLの管にひき肉のティッシュを移す。5 mLの AdDF+++をペトリ皿に加え、洗浄し、10 mLの滅菌ピペットで培地を回収します。すべての内容物を同じチューブに移します。 室温で5分間300×gで遠心分離機を出し、上清を取り除きます。15 mL チューブに3~4 mLのコラゲナーゼ溶液を加えます。37 °Cの水平シェーカーセットと250rpmの速度にチューブを移動します。 インキュベーションの最初の15分後、サンプルを確認し、チューブを激しく振ります。懸濁液が均質で、ほとんどの組織片が消失するまで繰り返し、最大インキュベーション時間は45〜60分である(図1B)。 チューブをAdDF+++で埋め、チューブを5-10倍に反転して混ぜます。4°Cで5分間300×gで遠心分離機を出し、上清を取り除く。 ペレットが赤の場合は、ステップ 1.2.6 に進みます。それ以外の場合は、ステップ 1.2.8 に進みます。 細胞ペレットの上に赤血球のリシスバッファー( 材料表を参照)の1 mLを加えます。チューブを軽くタップしてペレットを再中断します(ピペットチップで再中断しないでください)。室温で5分間インキュベートします。 チューブを AdDF+++ で埋めます。4°Cで5分間300×gで遠心分離機を出し、上清を取り除く。 血液細胞がまだ見える場合は、ステップ1.2.6から始めて、もう一度手順を繰り返します。それ以外の場合は、ステップ 1.2.8 に進みます。 プロトコルのこの時点で組織の塊が見える場合は、ステップ1.2.8に進みます。それ以外の場合は、ステップ1.2.9でペレット体積の測定を進める。チューブに5 mLのAdDF+++を加え、10 mLの滅菌ピペットで再中断します。50 mLチューブに置かれた100 μmのナイロンセルストレーナーでサスペンションをフィルターします。 濾過した懸濁液を新しい15 mLチューブに移します。4°Cで5分間300×gで遠心分離機を出し、上清を取り除く。 p1000ピペットを使用して細胞ペレットの体積を測定します。気泡を作成せずに再中断するために慎重に上下にピペット。チューブを氷に1分間移します。 ペレットに70~75%のBMEを加えます。p1000またはp200ピペットを使用して再中断し、プレウォームされたマルチウェル細胞培養プレート(6、12、または24ウェル、総めっき量(200 μL、6ウェル)にプレート15 μLの液滴を使用して再中断します。 プレートを裏返しにし、プレートを37°Cで15〜20分間インキュベーターで休ませる(図1C)。温かくした培養培地を加え、培養物を検査する(図1C、D)。 2. 尿からのヒト腎臓結管の生成 注:尿は細胞にとって敵対的な環境です。尿サンプルは、できるだけ早く、好ましくは排泄から4時間以内に処理されることが、このプロトコルの正常な実行のために重要である。その間、尿サンプルは4°Cで保存する必要があります。 料 プレウォームマルチウェル組織培養プレート(6、12および24ウェル)を一晩で37°Cで行う。 洗浄媒体を準備する: AdDF+++は広域スペクトル抗生物質(0.1 mg/mL)および10 μM Y-27632を添加した。 上述したように培地を調製する。使用前に37°Cでウォームアップしてください。 BME マトリックスを準備します。手順中に氷の上に保管してください。 プロシージャ 尿サンプルを採取し、それを50mLチューブに均等に分割する(図2A-I)。各チューブに10〜20mLの洗浄媒体を加えます。4°Cで5分間300×gの遠心分離機(図2A-II)、上清を慎重に取り除きます。 各チューブに10mLの洗浄媒体を加えます。10 mLの滅菌ピペットを使用してペレットを慎重に再懸濁します。4°Cで5分間300xgの遠心分離機(図2A-III)、上清を慎重に取り除きます。 ペレットを再懸濁し、すべてのチューブの内容物を15 mLチューブに移します。チューブに洗浄媒体を充填します。4°Cで5分間300xgの遠心分離機(図2A-IV)、上清を取り除く。 p1000ピペットを使用して細胞ペレットの体積を測定します。気泡を作成せずに再中断するために慎重に上下にピペット。チューブを氷に1分間移します。 ペレットにBMEの70〜75%の体積を加えます。p1000またはp200ピペットを使用して再中断し、プレウォームされたマルチウェル細胞培養プレート(6、12、または24ウェル、総めっき量(200 μL、6ウェル)にプレート15 μLの液滴を使用して再中断します。 37°Cで15〜20分間、インキュベーターでプレートを逆さまにします。 温め込まれた培養培地を加え、培養物を検査する(図2B)。 3. チューブロイド培養の拡大 注:チューブロイド培養は、1:2-1:3の分割比で、およそ1〜2週間ごとに通過することができます。これらは通常、ライン固有のバリエーションで、約15の通路のために拡張することができます。 料 プレウォームマルチウェル組織培養プレート(6、12および24ウェル)を一晩で37°Cで行う。 基礎培地 (AdDF+++) を準備し、手順中に氷の上に保管します。 先に述べたように培地を調製する。使用前に37°Cまで温める。 BMEマトリックスを準備し、手順中に氷の上に保ちます。 Y-27632を濃度10μMに添加してトリプシン交換剤を調製し、使用前に37°Cまで温めます。 フィルターなしの p10 ヒントをオートクレーブします。 遠心分離機を4°Cに冷却します。 プロシージャ ウェルに存在する培地を使用してp1000ピペットで上下にピペットを入れ、管状体を含む液滴を破壊する。先端を使用して井戸の底を削り取り、底部に取り付けられたすべてのセルを収集します。 15 mLチューブに入った内容物を集めろ。10 mL の AdDF+++ を追加します。4°Cで5分間 300xg で遠心分離機を、上清を取り除く。 ペレットのサイズに基づいて、10 μM Y-27632を補ったトリプシン交換剤を添加します。細管を含むBME液滴の200 μLに対して1mLのトリプシン交換剤を使用してください。37°Cで5分間インキュベートします。 チップ付きのp1000ピペットを使用し、1000 μLチップの上に非濾過済みの無菌p10チップを挿入します。ピペットは20〜30倍の上下に、オルガノイドを機械的に破壊する。 顕微鏡下で、多くの無傷のオルガノイドがまだチューブに存在しているかどうかを確認してください(図3A)。この時点でインタクトオルガノイドの10%以上が存在する場合、ステップ3.2.3の5分間のインキュベーションから、ステップ3.2.5でインタクトオルガロイドの顕微鏡観察までもう一度繰り返す。それ以外の場合は、ステップ 3.2.6 に進みます。 チューブを AdDF+++ で埋めます。遠心分離機300×gで5分間4°Cで5分間、上清を取り除く。p1000ピペットを使用して細胞ペレットの体積を測定します。気泡を作成せずに再中断するために慎重に上下にピペット。チューブを氷に1分間移します。 ペレットに70~75%のBMEを加えます。p1000またはp200ピペットを使用して再中断し、プレウォームされたマルチウェル細胞培養プレート(6、12、または24ウェル、総めっき量(200 μL、6ウェル)にプレート15 μLの液滴を使用して再中断します。 プレートを裏返しにし、プレートを37°Cで15〜20分間保育器で休ませます。 温かくした培養培地を加え、培養物を検査する(図3B)。