从组织和尿液中产生人类肾脏结核

注：此处描述的实验已获得伊拉斯谟医疗中心（荷兰鹿特丹）医学伦理委员会和墨西哥公主儿科肿瘤中心（荷兰乌得勒支）的批准。 1. 从组织中产生人类肾管 材料 预温多井组织培养板（6，12和24井）在37°C过夜。 准备基底介质 （AdDF++） 通过添加 1x L-丙氨酸/L-谷氨酰胺补充剂， 1% w/v 4-（2-羟基乙酰） -1 – 管道拉青素乙醇酸 （HEPES， 10 mM）， 和 1% 青霉素/链霉素抗生素高级 DMEM/F12. 准备培养介质通过添加 1.5% B27 补充， 10% R 海绵丁条件介质， 表皮生长因子（50 ng/mL）、成纤维细胞生长因子-10（100 ng/mL）、N-乙酰半胱氨酸（1.25 mM）、罗基纳斯 抑制剂 Y-27632 （10 μM）、广谱抗生素 （0.1 毫克/毫升） 和 A83-01 （5 μM） 至 AdDF++ 。 使用前加热至 37 °C。 在 4 °C 下隔夜解冻，准备地下室膜提取物 （BME）。 在手术过程中将 BME 放在冰上。 通过将拼贴剂稀释至 AdDF+®中最终浓度为 1 毫克/mL，并添加 10 μM Y-27632 来准备拼贴剂溶液。预热至 37 °C。 准备 10 厘米的佩特里菜、手术刀和钳子。使用紫外线灯对器皿进行20分钟的消毒，然后用消毒剂、demi水和70%v/v乙醇清洗。空气干燥的器皿。 将水平摇床预温至 37 °C。 程序 在充满 30-40 mL AdDF++介质的 50 mL 管中收集肾脏组织。将组织片放在 10 厘米的培养皿中，中间为 ±1 mL。用手术刀将组织切成+1毫米3大小的碎片（图1A）。 使用钳子和手术刀将切碎的组织转移到 15 mL 管中。在培养皿中加入 5 mL 的 AdDF++，用 10 mL 无菌移液器清洗和收集介质。将所有这些内容转移到同一管中。 离心机在室温下300× 克 5分钟，并取出超高线。在 15 mL 管中加入 3-4 mL 拼贴液解决方案。将管子移到 37 °C 水平摇床，转速为 250 rpm。 孵化前15分钟后，检查样品并大力摇动管子。重复，直到悬浮是同质的，大多数组织片已经消失，最大潜伏时间为45-60分钟（图1B）。 将管子装满AdDF++，通过倒置管子5-10倍进行混合。离心机在 300 × g 5 分钟在 4 °C， 并删除超高。如果颗粒为红色，则继续执行步骤 1.2.6。否则，请前往第 1.2.8 步。 在细胞颗粒上添加1mL的红细胞裂解缓冲器（见 材料表）。轻轻敲击管子以重新悬念颗粒（不要用移液器尖端重新悬念）。在室温下孵育5分钟。 用AdDF++填充管子。离心机在 300 × g 5 分钟在 4 °C， 并删除超高。如果血细胞仍然可见，从第 1.2.6 步开始，再次重复该过程。否则，继续执行第 1.2.8 步。 如果在协议的这一点可见组织块，则继续执行第 1.2.8 步。否则，继续测量颗粒体积的第 1.2.9 步。在管子中加入 5 mL 的 AdDF+++，然后用 10 mL 无菌移液器重新使用。通过放置在 50 mL 管上的 100 μm 尼龙细胞过滤器过滤悬架。 将过滤过的悬架转移到新的 15 mL 管中。离心机在 300 × g 5 分钟在 4 °C， 并删除超高。使用设置为已知体积的 p1000 移液器测量细胞颗粒的体积。小心地上下移液器，在不产生气泡的情况下重新使用。将管子转移到冰上1分钟。 在颗粒中加入 70-75% 的 BME 体积。使用 p1000 或 p200 移液器进行重复， 和板 15 μL 液滴在预温， 多井细胞培养板 （6， 12， 或 24 井， 基于总电镀体积 （200 μL， 6 井）） 。 将盘子倒置，让盘子在37°C（图1C）下在孵化器中休息15-20分钟。添加预温文化媒介，并检查文化（图1C，D）。 2. 尿液中人类肾管的生成 注：尿液是细胞的敌对环境。要成功地执行此协议，必须尽快处理尿样，最好是在排泄后 4 小时内处理。同时，尿样应储存在4°C。 材料 预温多井组织培养板（6，12和24井）在37°C过夜。 准备洗涤介质：AdDF++补充广谱抗生素（0.1毫克/毫升）和10μM Y-27632。 准备上面所述的文化媒介。使用前在 37 °C 处预热。 准备 BME 矩阵。在手术过程中保持冰上。 程序 收集尿液样本，并将其平均分成50 mL管（图2A-I）。在每个管子中加入 10-20 mL 的洗涤介质。离心机在300×克5分钟在4°C（图2A-II），并小心地删除超高。 在每个管子中加入 10 mL 的洗涤介质。使用 10 mL 无菌移液器小心地重新使用颗粒。离心机在300×g 5分钟在4°C（图2A-III），并小心地删除超高。 重新使用颗粒，并将所有管子中的内容转移到一个 15 mL 管中。用洗涤介质填充管子。离心机在300×g 5分钟在4°C（图2A-IV），并删除超高。 使用设置为已知体积的 p1000 移液器测量细胞颗粒的体积。小心地上下移液器，在不产生气泡的情况下重新使用。将管子转移到冰上1分钟。 将 BME 的 70-75% 体积添加到颗粒中。使用 p1000 或 p200 移液器进行重复， 和板 15 μL 液滴在预温， 多井细胞培养板 （6， 12， 或 24 井， 基于总电镀体积 （200 μL， 6 井）） 。 在 37 °C 下将板倒置在孵化器中 15-20 分钟。 添加预温文化媒介，并检查文化（图2B）。 3. 扩大管状文化 注：Tubuloid 培养物大约每 1-2 周可以通过一次，拆分比为 1：2-1：3。它们通常可以扩展为大约 15 个通道，并具有特定于线的变体。 材料 预温多井组织培养板（6，12和24井）在37°C过夜。 准备基底介质（AdDF++），并在手术过程中将其放在冰上。 准备如前所述的文化媒介。使用前加热至 37 °C。 准备 BME 矩阵，并在手术过程中保持冰上。 准备试丁香替代剂，在10μM浓度下加入Y-27632。 使用前加热至37°C。 高压灭菌器非过滤 p10 提示。 将离心机冷却到 4 °C。 程序 使用井中的介质，用 p1000 移液器上下管道，破坏含有管状物的液滴。使用尖端刮打井底，确保收集连接到底部的所有细胞。 在 15 mL 管中收集内容。添加 10 mL 的 AdDF++ 。离心机在 300 x g 5 分钟在 4 °C， 并删除超高。 根据颗粒的大小，添加10μM Y-27632补充的试丁香替代剂。使用 1 mL 的试丁香替代剂 200 μL 含有管状体的 BME 液滴。在 37 °C 下孵育 5 分钟。 使用带尖端的 p1000 移液器，并在 1000 μL 尖端上插入未过滤的无菌 p10 尖端。皮佩特上下20-30倍机械地破坏器官。 在显微镜下检查，看看管子中是否仍然存在许多完整的器官（图3A）。如果此时存在超过 10% 的完整器官，则重复从步骤 3.2.3 中的 5 分钟孵化到第 3.2.5 步中完整器官的微观观察。否则，继续执行第 3.2.6 步。 用AdDF++填充管子。离心机在 300 × g 5 分钟在 4 °C 下，并删除超高。使用设置为已知体积的 p1000 移液器测量细胞颗粒的体积。小心地上下移液器，在不产生气泡的情况下重新使用。将管子转移到冰上1分钟。 在颗粒中加入 70-75% 的 BME 体积。使用 p1000 或 p200 移液器进行重复， 和板 15 μL 液滴在预温， 多井细胞培养板 （6， 12， 或 24 井， 基于总电镀体积 （200 μL， 6 井）） 。 将盘子倒置，让盘子在37°C下在孵化器中休息15-20分钟。 添加预温文化媒介，并检查文化（图3B）。