Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

Die Netzhaut von Wirbeltieren ist ein wichtiges Modellsystem für die Erforschung der neuronalen Entwicklung. Trotz ihrer peripheren Lage ist die Netzhaut anatomisch und entwicklungsbedingt eine Erweiterung des zentralen Nervensystems, und der Sehnerv, der aus Axonen retinaler Ganglienzellen besteht, stellt einen Trakt innerhalb des zentralen Nervensystems dar. Die Netzhaut von Küken hat als Modellsystem zur Untersuchung des molekularen Mechanismus der neuronalen Entwicklung erhebliche Vorteile: Sie ist groß und entwickelt sich schnell; Es hat strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten mit der menschlichen Netzhaut; Es ist für Visualisierungen und experimentelle Manipulationen leicht zugänglich. Molekulare Mechanismen der Zellproliferation und -differenzierung, der Morphogenese und der Axonführung während der neuronalen Entwicklung wurden mit Hilfe der Hühnerretina umfassend untersucht.

Die In-ovo-Elektroporation wurde in den letzten zwei Jahrzehnten erfolgreich eingesetzt, um ektopische Gene in Zellen des sich entwickelnden Kükenembryos einzuschleusen. Diese Technik ermöglicht die Markierung von sich entwickelnden Zellen, die Verfolgung des Zellschicksals und die Rückverfolgung von Zellmigration und Axonbahnen sowie die ektopische Genexpression für die In-vivo-Analyse der Genfunktion. Die Bedingungen der in ovo Elektroporation für eine effiziente ektopische Genexpression in Kükenembryonen sind gut etabliert ^1,2,3.

Trotz dieser Vorteile war das Fehlen einer stabilen Loss-of-Function-Technik für die Untersuchung der Genfunktion eine wesentliche technische Einschränkung des Kükenembryos. Während Kükenembryonen, die mit kleinen interferierenden RNAs (siRNAs)4 oder Expressionsvektoren für kurze Haarnadel-RNAs (shRNAs⁾⁵ elektroporiert wurden, einen Knockdown des Zielgens zeigen, ist die Gensuppression bei diesen Ansätzen vorübergehend^, da die Effekte verschwinden, sobald die Zellen die eingeführten RNAs oder DNAs verlieren. Eine stabilere Gensuppression kann durch die Verabreichung von siRNAs in Kükenembryonen durch ein RCAS-Retrovirussystem (R eplication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a S pliceacceptor) erreicht werden⁶. Der virale Vektor integriert sich in das Wirtsgenom und die ektopischen Gene werden stabil exprimiert. Das Retrovirus kann sich jedoch nur während der mitotischen (M)-Phase des Zellzyklus in das Genom sich teilender Zellen integrieren, was die Entwicklungsstadien und/oder Zelltypen, für die dieser Loss-of-Function-Ansatz angewendet werden kann, einschränken kann. Darüber hinaus scheint die Expression von Transgenen durch RCAS langsamer und weniger robust zu sein als diejenige, die durch In-ovo-Elektroporation induziert wird⁷.

Transposons sind genetische Elemente, die sich von einer Stelle im Genom zu einer anderen bewegen. Das Tol2-Element ist ein Mitglied der Familie der hAT-transponierbaren Elemente und enthält ein internes Gen, das für eine Transposase kodiert, die die Transposon-Reaktion des Tol2-Elements⁸ katalysiert. Wenn ein Plasmidvektor, der eine Genexpressionskassette trägt, die von den Sequenzen des linken und rechten Endes der Tol2-Elemente (200 bp bzw. 150 bp) flankiert wird, mit einem Tol2-Transposase-Expressionskonstrukt in Wirbeltierzellen eingeführt wird, wird die Expressionskassette aus dem Plasmid herausgeschnitten und in das Wirtsgenom integriert, das eine stabile Expression des ektopischen Gens unterstützt (Abbildung 1). Es wurde gezeigt, dass das transponierbare Element Tol2 die Gentransposition in verschiedenen Wirbeltierarten, einschließlich Zebrafisch 9,10, Frösche 11, Küken¹² und Mäuse^13, sehr effizient induzieren kann und somit eine nützliche Methode der Transgenese und Insertionsmutagenese ist. Das Tol2-Transposon-System wurde erfolgreich für den konditionalen Knockdown eines Zielgens durch genomische Integration von siRNA eingesetzt, die aus langer doppelsträngiger RNA¹⁴ prozessiert wird.

Dieses Protokoll beschreibt einen Loss-of-Function-Ansatz im Kükenembryo, bei dem künstliche microRNAs (miRNAs) durch das Tol2-Transposon-System eingeführt werden^15,16. Bei diesem Ansatz wird eine Expressionskassette für den EmGFP-Marker (smaragdgrün fluoreszierendes Protein) und künstliche miRNAs gegen ein Zielgen in einen Tol2-Transposon-Vektor kloniert. Das Tol2-Transposon-Konstrukt wird dann mit einem Tol2-Transposase-Expressionskonstrukt durch In-ovo-Elektroporation in die embryonale Kükennetzhaut eingeführt. In den transfizierten Netzhautzellen katalysiert die Transposase die Exzision der Expressionskassette aus dem Transposon-Vektor und deren Integration in die Wirtschromosomen, was zu einer stabilen Expression von miRNAs und des EmGFP-Proteins führt. In unseren früheren Studien ist es uns gelungen, die Expression von Nel, einem extrazellulären Glykoprotein, das hauptsächlich im Nervensystem exprimiert wird, in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken zu reduzieren (siehe Repräsentative Ergebnisse). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit dieser Technik eine stabile und effiziente Gensuppression in ovo erreicht werden kann.