使用Tol2转座子介导的人工microRNA的转基因表达在胚胎雏鸡视网膜中实现功能丧失的方法

脊椎动物视网膜是研究神经发育的重要模型系统。尽管视网膜位于外围位置，但在解剖学和发育上是中枢神经系统的延伸，视神经由视网膜神经节细胞的轴突组成，代表中枢神经系统内的束。小鸡视网膜作为研究神经发育分子机制的模型系统具有显著优势：体型大，发育迅速;它与人类视网膜具有结构和功能相似性;它很容易用于可视化和实验操作。利用鸡视网膜广泛研究了神经发育过程中细胞增殖和分化、形态发生和轴突引导的分子机制。

在过去的二十年中，卵子电穿孔已成功用于将异位基因引入发育中的雏鸡胚胎中的细胞中。该技术允许标记发育中的细胞，细胞命运追踪，细胞迁移和轴突束的追踪，以及异位基因表达，用于基因功能的体内分析。卵内电穿孔在鸡胚胎中有效表达异位基因的条件^{已经确立1,2,3}。

尽管有这些优点，但缺乏用于基因功能研究的稳定功能丧失技术一直是雏鸡胚胎的主要技术限制。虽然用小干扰RNA（siRNA）⁴或短发夹RNA（^shRNA）5的表达载体电穿孔的鸡胚胎显示出靶基因的敲低，但这些方法中的基因抑制是短暂的，因为一旦细胞失去引入的RNA或DNA，这种影响就会消失。通过RCAS（R转换Competent A型肉瘤-白血病病毒（ASLV）长末端重复（LTR）与S板受体）逆转录^{病毒系统将}siRNA递送到雏鸡胚胎中可以实现更稳定的基因抑制6。病毒载体整合到宿主基因组中，异位基因稳定表达。然而，逆转录病毒只能在细胞周期的有丝分裂（M）阶段整合到分裂细胞的基因组中，这可能会对可以应用这种功能丧失方法的发育阶段和/或细胞类型施加限制。此外，RCAS对转基因的表达似乎比卵电穿孔诱导的表达更慢且更不^稳定7。

转座子是从基因组上的一个位置移动到另一个位置的遗传元件。Tol2元件是hAT转座元件家族的成员，包含一个编码转座酶的内部基因，该转座酶催化Tol2元件⁸的转座子反应。当携带基因表达盒的质粒载体被引入具有Tol2转座酶表达构建体的脊椎动物细胞中时，将携带基因表达盒的质粒载体，两侧是Tol2元件的左端和右端序列（分别为200 bp和150 bp），将表达盒从质粒中切除并整合到宿主基因组中，从而支持异位基因的稳定表达（图1).已经表明，Tol2转座元件可以非常有效地诱导不同脊椎动物物种的基因转位，包括斑马鱼^9,10，青蛙11，小鸡12和小鼠^13，因此是一种有用的转基因和插入诱变方法。Tol2转座子系统已成功用于通过从长双链RNA¹⁴加工的siRNA的基因组整合来条件敲低靶基因。

该协议描述了雏鸡胚胎中的功能丧失方法，该方法涉及通过Tol2转座子系统引入人工microRNA（miRNA）^15,16。在这种方法中，将EmGFP（翡翠绿色荧光蛋白）标记物的表达盒和针对靶基因的人工miRNA克隆到Tol2转座子载体中。然后将Tol2转座子构建体通过卵电穿孔将Tol2转座酶表达构建体引入胚胎小鸡视网膜中。在转染的视网膜细胞中，转座酶催化从转座子载体中切除表达盒并将其整合到宿主染色体中，从而导致miRNA和EmGFP蛋白的稳定表达。在我们之前的研究中，我们成功地敲低了Nel的表达，Nel是一种主要在神经系统中表达的细胞外糖蛋白，在发育中的小鸡视网膜中（见代表性结果）。我们的结果表明，通过该技术可以在卵中实现稳定有效的基因抑制。