인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법
Summary
우리는 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템을 사용하여 병아리 배아에 인공 마이크로 RNA 서열을 도입하고 게놈 통합하는 새로운 기능 상실 접근 방식을 개발했습니다. 이 기술은 개발 중 유전자 기능 연구를 위한 강력하고 안정적인 유전자 녹다운 방법론을 제공합니다.
Abstract
병아리 망막은 오랫동안 발달 신경 생물학에서 중요한 모델 시스템이었으며 큰 크기, 빠른 발달, 시각화 및 실험 조작을 위한 접근성 등의 장점이 있습니다. 그러나 주요 기술적 한계는 유전자 기능 분석을 위한 강력한 기능 상실 접근법이 없다는 것이었습니다. 이 프로토콜은 Tol2 트랜스포존 시스템을 사용하여 인공 microRNA(miRNA)의 형질전환 발현을 포함하는 발달 중인 병아리 망막에서 유전자 침묵 방법론을 설명합니다. 이 접근법에서, EmGFP(에메랄드 그린 형광 단백질) 마커에 대한 발현 카세트와 표적 유전자에 대한 인공 pre-miRNA 서열을 포함하는 Tol2 트랜스포존 플라스미드는 난소 전기천공에 의해 Tol2 트랜스포사제 발현 구조체와 함께 배아 병아리 망막에 도입됩니다. 형질감염된 망막 세포에서 전이효소는 트랜스포존 벡터에서 발현 카세트의 절제와 숙주 염색체로의 통합을 촉매하여 miRNA 및 EmGFP 단백질의 안정적인 발현을 유도합니다. 이전 연구에서 우리는 이 기술을 사용하여 신경 발달에서 여러 기능을 발휘하는 당단백질인 Nel의 발현이 발달 중인 병아리 망막에서 크게 억제될 수 있음을 입증했습니다. 우리의 결과는 이 방법론이 유전자 발현의 안정적이고 강력한 억제를 유도하여 망막 발달 연구를 위한 효율적인 기능 상실 접근법을 제공한다는 것을 나타냅니다.
Introduction
척추동물 망막은 신경 발달을 연구하기 위한 중요한 모델 시스템입니다. 말초 위치에도 불구하고 망막은 해부학적으로나 발달적으로 중추 신경계의 확장이며, 망막 신경절 세포의 축삭으로 구성된 시신경은 중추 신경계 내의 관을 나타냅니다. 병아리 망막은 신경 발달의 분자 메커니즘을 연구하는 모델 시스템으로서 상당한 이점을 가지고 있습니다. 그것은 인간 망막과 구조적 및 기능적 유사성을 가지고 있습니다. 시각화 및 실험적 조작을 위해 접근성이 높습니다. 신경 발달 중 세포 증식 및 분화, 형태 형성 및 축삭 유도의 분자 메커니즘은 닭 망막을 사용하여 광범위하게 연구되었습니다.
난소에서 전기천공법은 발달 중인 병아리 배아의 세포에 이소성 유전자를 도입하기 위해 지난 20년 동안 성공적으로 사용되었습니다. 이 기술은 발달 중인 세포의 표지, 세포 운명 추적, 세포 이동 및 축삭관 추적, 유전자 기능의 생체 내 분석을 위한 이소성 유전자 발현을 가능하게 합니다. 병아리 배아에서 효율적인 이소성 유전자 발현을 위한 난소 전기천공법의 조건은 잘 확립되어 있다 1,2,3.
이러한 장점에도 불구하고 유전자 기능 연구를 위한 안정적인 기능 상실 기술의 부족은 병아리 배아의 주요 기술적 한계였습니다. 작은 간섭 RNA(siRNA)4 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)5 에 대한 발현 벡터로 전기천공된 병아리 배아는 표적 유전자의 녹다운을 나타내는 반면, 세포가 도입된 RNA 또는 DNA를 잃으면 효과가 사라지기 때문에 이러한 접근 방식에서 유전자 억제는 일시적입니다. 보다 안정적인 유전자 억제는 RCAS(Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus(ASLV) long terminal repeat) with a Splice acceptor) 레트로바이러스 시스템에 의해 siRNA를 병아리 배아에 전달함으로써 달성될 수 있다6. 바이러스 벡터는 숙주 게놈에 통합되고 이소성 유전자는 안정적으로 발현됩니다. 그러나 레트로바이러스는 세포 주기의 유사분열(M) 단계 동안에만 분열하는 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 이는 이러한 기능 상실 접근법을 적용할 수 있는 발달 단계 및/또는 세포 유형에 제한을 가할 수 있습니다. 또한, RCAS에 의한 이식유전자의 발현은 ovo전기천공법(ovo)전기천공법( ovo electroporation)에 의해 유도된 것보다 느리고 덜 견고하게 나타난다7.
트랜스포존은 게놈의 한 위치에서 다른 위치로 이동하는 유전적 요소입니다. Tol2 요소는 hAT 전치 가능한 요소 패밀리의 구성원이며, Tol2 요소8의 트랜스포존 반응을 촉매하는 트랜스포사제를 코딩하는 내부 유전자를 함유한다. Tol2 요소(각각 200 bp 및 150 bp)의 좌측 및 우측 말단의 서열에 의해 측면 배치된 유전자 발현 카세트를 운반하는 플라스미드 벡터가 Tol2 전이효소 발현 구조체를 갖는 척추동물 세포 내로 도입될 때, 발현 카세트는 플라스미드로부터 절제되어 이소성 유전자의 안정적인 발현을 지원하는 숙주 게놈 내로 통합된다(도 1). Tol2 전치 요소는 제브라피쉬9,10, 개구리 11, 병아리12 및 생쥐 13을 포함한 다양한 척추동물 종에서 유전자 전이를 매우 효율적으로 유도할 수 있는 것으로 나타났으며, 따라서 형질전환 및 삽입 돌연변이 유발에 유용한 방법입니다. Tol2 트랜스포존 시스템은 긴 이중 가닥 RNA14에서 처리되는 siRNA의 게놈 통합에 의한 표적 유전자의 조건부 녹다운에 성공적으로 사용되었습니다.
이 프로토콜은 Tol2 트랜스포존 시스템15,16에 의한 인공 마이크로RNA(miRNA)의 도입을 포함하는 병아리 배아에서의 기능 상실 접근법을 설명한다. 이 접근법에서는 표적 유전자에 대한 EmGFP(에메랄드 그린 형광 단백질) 마커 및 인공 miRNA에 대한 발현 카세트를 Tol2 트랜스포존 벡터에 클로닝합니다. 이어서, Tol2 트랜스포존 구축물은 난소 전기천공에 의해 Tol2 트랜스포사제 발현 구축물과 함께 배아 병아리 망막 내로 도입된다. 형질감염된 망막 세포에서 전이효소는 트랜스포존 벡터에서 발현 카세트의 절제와 숙주 염색체로의 통합을 촉매하여 miRNA 및 EmGFP 단백질의 안정적인 발현을 유도합니다. 우리의 이전 연구에서, 우리는 발달중인 병아리 망막에서 신경계에서 주로 발현되는 세포 외 당 단백질 인 Nel의 발현을 성공적으로 무너 뜨 렸습니다 (대표 결과 참조). 우리의 결과는 이 기술에 의해 ovo에서 안정적이고 효율적인 유전자 억제가 달성될 수 있음을 나타냅니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템에서 사용하는 인공 miRNA의 형질전환 발현에 의해 발달 중인 병아리 망막의 유전자 침묵에 대한 자세한 가이드를 제공합니다.
이 기술을 성공적으로 수행하는 데 중요한 요소는 다음과 같습니다. 첫째, 강력한 녹다운 효과를 발휘하는 것으로 확인된 miRNA 염기서열을 사용하는 것이 중요합니다. 생체 내 전기천공…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pT2K-CAGGS 및 pCAGGS-T2TP 벡터는 각각 Yoshiko Takahashi(Kyoto University, Kyoto, Japan)와 Koichi Kawakami(National Institute of Genetics, Mishima, Japan)에 의해 친절하게 제공되었습니다. 원고를 비판적으로 읽어준 Michael Berberoglu에게 감사드립니다. 이 연구는 왕립 학회와 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회 (BBSRC) (영국)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
Referencias
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