Gangliosidextraktion, -reinigung und -profilierung
Summary
Ganglioside sind Sialinsäure-tragende Glykosphingolipide, die im Gehirn besonders häufig vorkommen. Ihre amphipathische Natur erfordert organische/wässrige Extraktions- und Reinigungstechniken, um eine optimale Erholung und genaue Analysen zu gewährleisten. Dieser Artikel bietet einen Überblick über die analytische und präparative Gangliosidextraktion, -reinigung und -chromatographie-Analyse.
Abstract
Ganglioside sind Glykosphingolipide, die einen oder mehrere Sialinsäurereste enthalten. Sie kommen auf allen Wirbeltierzellen und -geweben vor, sind aber im Gehirn besonders häufig. Sie werden hauptsächlich auf dem äußeren Blatt der Plasmamembranen von Zellen exprimiert, modulieren die Aktivitäten von Zelloberflächenproteinen durch laterale Assoziation, fungieren als Rezeptoren in Zell-Zell-Interaktionen und sind Ziele für Krankheitserreger und Toxine. Genetische Dysregulation der Gangliosid-Biosynthese beim Menschen führt zu schweren angeborenen Erkrankungen des Nervensystems. Aufgrund ihrer amphipathischen Natur erfordern die Extraktion, Reinigung und Analyse von Gangliosiden Techniken, die von vielen Forschern in den 80 Jahren seit ihrer Entdeckung optimiert wurden. Hier beschreiben wir Methoden auf Laborebene für die Extraktion, Reinigung und vorläufige qualitative und quantitative Analysen der wichtigsten Ganglioside aus Geweben und Zellen, die in wenigen Stunden abgeschlossen werden können. Wir beschreiben auch Methoden zur großflächigen Isolierung und Reinigung der wichtigsten Gangliosidspezies aus dem Gehirn. Zusammen bieten diese Methoden analytischen und präparativen Zugang zu dieser Klasse bioaktiver Moleküle.
Introduction
Ganglioside sind definiert als Glykosphingolipide, die einen oder mehrere Sialinsäurereste enthalten1. Sie werden hauptsächlich an der Zelloberfläche exprimiert, wobei ihr hydrophober Ceramidlipidanteil in das äußere Blatt der Plasmamembran eingebettet ist und ihre hydrophilen Glykane sich in den extrazellulären Raum erstrecken2. Obwohl sie in Wirbeltierzellen und -geweben weit verbreitet sind, sind sie besonders häufig im Wirbeltiergehirn3, wo sie zuerst entdeckt und benannt wurden4.
Die Strukturen der Gangliosidglykane variieren und bilden die Grundlage für ihre Nomenklatur (Abbildung 1). Gangliosidglykane bestehen aus einem neutralen Zuckerkern, der unterschiedliche Anzahlen und Verteilungen von Sialinsäuren trägt. Das kleinste Gangliosid, GM4, hat nur zwei Zucker (Sialinsäure, die an Galaktose gebunden ist)5. Größere natürlich vorkommende Ganglioside können weit über ein Dutzend Gesamtzucker enthalten6 oder bis zu sieben Sialinsäuren auf einem einzigen neutralen Kern7. Ihre Ceramidlipidanteile variieren ebenfalls und haben unterschiedliche Sphingosinlängen und eine Vielzahl von Fettsäureamiden. Im Wirbeltiergehirn dominieren vier Gangliosidspezies, GM1, GD1a, GD1b und GT1b. Die Gangliosidexpression ist entwicklungsreguliert, gewebespezifisch und zelltypspezifisch.
Abbildung 1: Wichtige Hirnganglioside und ihre biosynthetischen Vorläufer. Strukturen werden mit der Symbolnomenklatur für Glykane angezeigt11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ganglioside wirken auf molekularer Ebene, indem sie Proteine in ihren eigenen Membranen einbinden und modulieren (cis-Regulation) oder indem sie Glykan-bindende Proteine im extrazellulären Milieu, einschließlich bakterieller Toxine und Lektine auf anderen Zellen (Trans-Erkennung), einsetzen3. Die spezifische Bindung von Gangliosiden an regulatorische Proteine und/oder die Selbstassoziation mit anderen Molekülen zu Lipidflößen führt zu Veränderungen des Zellverhaltens, die sich auf die Struktur und Funktion des Nervensystems, das Fortschreiten von Krebs, den Stoffwechsel, Entzündungen, neuronale Proteinopathien und Infektionskrankheiten auswirken8. Aufgrund ihrer vielfältigen zellulären Rollen können Methoden zu ihrer Isolierung und Analyse verbesserte Einblicke in die Regulation physiologischer und pathologischer Prozesse liefern. Hier werden validierte Methoden für die schnelle Extraktion und Analyse im kleinen Maßstab und die präparative Isolierung von Gangliosiden aus dem Gehirn bereitgestellt. Chancen und Herausforderungen für die Anwendung auf andere Gewebe werden diskutiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen Methoden zur Extraktion und Isolierung von Gangliosid in kleinem und großem Maßstab sind nicht einzigartig – es gibt viele verschiedene Lösungsmittelextraktions- und Reinigungsansätze, die hervorragende Ergebnisse liefern12. Die hier berichteten Methoden zur Reinigung in kleinem Maßstab aus dem Gehirn, von Fredman und Svennerholm13, haben gezeigt, dass sie die Rückgewinnung optimieren und sich über viele Jahre in unserem Labor als robust und un…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health (NIH) Common Fund for Glycoscience Grant U01CA241953 unterstützt. MJP wurde vom Chemistry-Biology Interface Program an der Johns Hopkins University (T32GM080189) unterstützt.
Materials
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe – Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe – Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
Referencias
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