Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso, con consejos para generar xenoinjertos y directrices para el análisis del comportamiento tumoral, la inmunofluorescencia de montaje completo y la cuantificación de imágenes confocales.
Xenoinjertos larvales de pez cebra están siendo ampliamente utilizados para la investigación del cáncer para realizar estudios in vivo y en tiempo real del cáncer humano. La posibilidad de visualizar rápidamente la respuesta a las terapias anticáncer (quimio, radioterapia y biológicos), angiogénesis y metástasis con resolución unicelular, coloca al xenoinjerto de pez cebra como una de las mejores opciones para desarrollar estudios preclínicos.
El ensayo de xenoinjerto larval de pez cebra presenta varias ventajas experimentales en comparación con otros modelos, pero probablemente la más llamativa es la reducción de tamaño de escala y consecuentemente de tiempo. Esta reducción de escala permite la obtención de imágenes unicelulares, el uso de un número relativamente bajo de células humanas (compatible con biopsias), exámenes de detección de fármacos de rendimiento medio-alto, pero lo más importante permite una reducción significativa del tiempo del ensayo. Todas estas ventajas hacen que el ensayo de xenoinjerto de pez cebra sea extremadamente atractivo para futuras aplicaciones de medicina personalizada.
Muchos protocolos del xenoinjerto del pez cebra se han desarrollado con una amplia diversidad de tumores humanos; sin embargo, todavía falta un protocolo general y estandarizado para generar eficientemente xenoinjertos larvales de pez cebra. Aquí proporcionamos un protocolo paso a paso, con consejos para generar xenoinjertos y directrices para el análisis del comportamiento tumoral, la inmunofluorescencia de montaje completo y la cuantificación de imágenes confocales.
El pez cebra (Danio rerio) está emergiendo como un poderoso organismo modelo de vertebrados para estudiar el desarrollo y la enfermedad. El pez cebra comparte características genéticas altamente conservadas (~70% de homología genética y ~84% genes relacionados con enfermedades) y características morfológicas básicas de órganos con los humanos1,2. Esta conservación permite el uso del pez cebra para modelar varias enfermedades humanas, incluyendo el cáncer3,4.
El manejo y mantenimiento del pez cebra es mucho más fácil y rentable que los ratones debido a su pequeño tamaño, alta fecundidad durante todo el año y fertilización externa3,5. Los embriones de pez cebra no requieren alimentación viva durante sus primeros 5-7 días de vida y se han utilizado como un modelo eficaz para el desarrollo, la infección y el cáncer1,4,6,7. Los embriones de pez cebra eclosionan a las 48 horas después de la fertilización (hpf) y son animales que nadan libremente con todos los órganos formados, un corazón latiendo y un sistema circulatorio funcional, hígado, cerebro, médula renal, etc.1,3. Además, en esta etapa de desarrollo sólo la inmunidad innata está en juego, la inmunidad adaptativa todavía se está desarrollando, lo que permite un injerto general eficiente de las células humanas sin necesidad de uso de mutantes inmunocomprometidos7,8. Sin embargo, es importante señalar que no todas las células humanas se injerten por igual9 y que, por ejemplo, para las células leucémicas se demostró que los fagocitos (neutrófilos y macrófagos) necesitan ser agotados para un injerto eficiente10.
La capacidad de tracción genética del pez cebra y la transparencia óptica de sus primeras etapas embrionarias permiten obtener imágenes intravitales unicelulares a una alta resolución y, por lo tanto, para el establecimiento de técnicas de imagen de vanguardia en diversos campos de la biología. Además, en el contexto del cáncer, estas características son útiles para estudios en tiempo real de las primeras etapas de las interacciones huésped-tumor, como el estudio del potencial angiogénico y metastásico, así como las interacciones con el sistema inmune innato8,9,11,12,13.
Aunque en el ensayo de xenoinjerto corto no hay tiempo para la “evolución” metastásica, es posible analizar la capacidad metastásica de las células tumorales (es decir, su eficiencia para pasar por pasos metastásicos como invasión, intravasación, supervivencia en circulación, extravasación y colonización, y por lo tanto estudiar estos procesos in vivo y en tiempo real8,11,13,14).
Las características de su ciclo de vida sitúan al pez cebra como un modelo único de medicina personalizada en cáncer. Los ensayos se pueden realizar en un lapso de tiempo más corto y los resultados se obtienen en unas pocas semanas7,8,9,11,12,15,16. La celeridad y viabilidad de estos ensayos proporcionan a médicos e investigadores la posibilidad de obtener resultados traslacionales que pueden ser útiles para los pacientes con cáncer, para quienes el tiempo es una necesidad esencial.
A pesar de los crecientes intentos de generar xenoinjertos de embriones de pez cebra exitosos, todavía hay una necesidad de la estandarización del procedimiento de inyección, así como la evaluación de la viabilidad celular y el comportamiento del tumor después de la inyección.
En este protocolo proporcionamos a investigadores una guía paso a paso clara y detallada para la inyección de líneas celulares humanas del cáncer en embriones del pez cebra y la fijación subsecuente, immunostaining, proyección de imagen, y cuantificación del comportamiento de la célula del tumor.
La creciente importancia del pez cebra como modelo para el desarrollo del cáncer y la detección de fármacos ha dado lugar a numerosas publicaciones3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. Sin embargo, la inyección de células cancerosas en embriones de pez cebra es una técnica que requiere un alto nivel de destreza que puede ser un desafío para los investigadores. En este protocolo pretendemos proporcionar información práctica y algunos consejos que puedan ayudar a superar los retos iniciales de la creación de xenoinjertos de embriones de pez cebra.
Manejo celular de inyección previa
Este protocolo optimizado para la generación de xenoinjertos de pez cebra con líneas celulares se puede adaptar a varios tipos de células (cancerosas) con diferentes morfologías. Recomendamos que todas las líneas celulares utilizadas para xenoinjertos de pez cebra estén libres de micoplasma. A diferencia de otras contaminaciones bacterianas, la presencia de micoplasma en el cultivo celular no genera cambios que puedan ser fácilmente detectados bajo el microscopio22. La contaminación por micoplasma puede afectar el potencial de injerto de las líneas celulares, su sensibilidad a los fármacos, así como la viabilidad de los embriones de pez cebra.
Aunque las células pueden continuar proliferando durante un período prolongado, su fenotipo y genotipo pueden ser propensos a cambios. Es importante familiarizarse con la morfología y el comportamiento de las líneas celulares en cultivo. Recomendamos mantener el número de pasajes celulares después de la descongelación entre 3-12 para obtener resultados reproducibles. Por lo tanto, se deben realizar pruebas regulares de micoplasma.
Las células deben estar en su fase logarítmica (fase de crecimiento exponencial antes de alcanzar la confluencia ~70%) en el día de la inyección. Esto permitirá un engraftment adecuado y un desarrollo apropiado de los sellos distintivos del tumor. Para prevenir la variación en el fenotipo de células dentro del xenoinjerto, es crítico mantener la confluencia para la inyección constante entre los experimentos. El número de células inyectadas se puede adaptar a las características de cada línea celular, ya que algunas pueden requerir densidades más altas de inyección para prosperar en los embriones de pez cebra.
Consideraciones sobre el etiquetado de las células
Para visualizar mejor las células tumorales humanas para su inyección y análisis futuro, las células tumorales se pueden etiquetar con colorantes fluorescentes. Debido a las diferencias en tamaño celular, el número total de cells/cm2 en cultivos adherentes varía entre las líneas celulares. Esto afectará la eficacia del protocolo de tinción, así como el número de células cosechadas para inyección. Las células grandes que producen números bajos por matraz (es decir, Hs578T) o crecen en grupos (es decir, BFTC905) requerirán la agrupación de varios matrazs para un solo experimento. En este caso, la tinción de las células no debe realizarse directamente en el matraz, ya que esto causará el uso de cantidades excesivas de colorante (alto costo). Por otro lado, las células que son altamente sensibles a los ciclos excesivos de centrifugación, así como las que producen un número elevado por matraz (es decir, HCT116) pueden teñirse directamente en el matraz y luego desprenderse con EDTA /raspador de células (para obtener más información, consulte la Tabla 1).
Siempre que sea posible, en lugar de usar un enfoque enzimático, use EDTA para separar las células el día de la inyección, de modo que las células recuperen sus uniones célula-célula más rápidamente y se someten a menos pasos de centrifugación. Sin embargo, si las células son sensibles a EDTA, muy adherentes o crecen en racimos, se puede aplicar un método enzimático. La optimización de la concentración ideal para inyección, así como del medio de inyección, depende de las características de cada línea celular, por lo que podría necesitar algunos ajustes (Tabla 1).
Calibración de microinyección
Contrariamente a la entrega de oligonucleótidos o fármacos en el embrión de pez cebra, una retícula no se utiliza para calibrar la aguja cuando se trabaja con líneas celulares para xenoinjertos. Después de algún tiempo durante la inyección, las células comenzarán a obstruirse, y es necesario cortar la punta de la aguja para aumentar su diámetro o cambiar la aguja por completo. Este procedimiento dificulta la calibración de la retícula.
Para abordar este problema, el número de células dispensadas está regulado por la presión de expulsión y el tiempo necesario para alcanzar un tamaño similar al ojo del embrión dentro de 1-3 pulsos. Luego, para controlar aún más el tamaño del tumor, a 1 dpi, los xenoinjertos se clasifican de acuerdo con el tamaño del tumor como se muestra en la Figura 6 B-B”. Como se representa en el ejemplo de la Figura 6C, este método de clasificación es eficiente para reducir la variación de los tamaños de los tumores: si los agrupamos todos juntos (+, ++, +++) el STEV es ~doble de la clase ++(~906 células a ~422 células) y la variación del coeficiente es de ~31,9% en comparación con el 14,5% en la clase ++. Dado que la referencia para la inyección es el volumen, el número total de células varía mucho entre los tipos de celdas, dependiendo del tamaño y la forma de las celdas. Por ejemplo, las células grandes con una gran cantidad de citoplasma como el cáncer de mama Hs578T, producen tumores mucho más pequeños (~ 600 células). Además, cada línea celular requiere un número diferente de celdas. Por ejemplo, las líneas celulares de cáncer de vejiga urinaria HT29 CRC y RT112 han demostrado que cuanto mayor es el número de células inyectadas, mayor es la mortalidad del pez cebra. Por lo tanto, se necesita un período de optimización durante el desarrollo de los xenoinjertos para probar si la línea celular tiene efectos tóxicos en el embrión o requiere densidades de inyección más altas / más bajas.
Sitio de inyección
Una de las discrepancias más comunes a la hora de generar xenoinjertos de embriones de pez cebra es el sitio de inyección. La yema suele ser el lugar de elección para la inyección debido a su fácil accesibilidad. Sin embargo, hemos observado que las células inyectadas en la yema tienen una mayor tendencia a morir. Aunque técnicamente más difícil, recomendamos inyectar en el PVS y lo más lejos posible del corazón. Dentro del PVS, las células pueden agregar, reclutar vasos y células inmunes, y migrar, intravasar, extravasar y formar micrometastasis, si presentan características metastásicas8,11.
Eficiencia del injerto
Se esperan diferencias en la eficiencia del injerto y el tamaño del tumor entre las líneas celulares a 4 dpi debido a sus distintos grados de muerte/supervivencia/proliferación de células basales, pero también debido a la inmunogenicidad innata que cada línea celular puede mostrar9.
metástasis
La metástasis comprende una cascada de varios pasos de eventos que se pueden dividir en dos etapas arbitrarias. En la primera etapa, las células tumorales tienen que desprenderse del sitio primario, migrar e invadir los tejidos adyacentes y luego intravasar en el torrente sanguíneo. En la segunda etapa, las células tumorales deben sobrevivir en circulación, extravasarse de la sangre o de los vasos linfáticos, y finalmente colonizar en sitios secundarios23. Para distinguir entre estos eventos tempranos y tardíos y abordar el potencial / competencia de las diferentes células tumorales para realizar estos pasos, diseñamos un ensayo simple.
En general, cuando se inyectan en el PVS, las células tumorales pueden entrar directamente en circulación y luego quedar atrapadas físicamente en el tejido hematopoyético caudal (CHT) (región de la cola). Sin embargo, de acuerdo con las características de cada célula tumoral, hemos visto que algunas células tumorales permanecen en el CHT 4 dpi y son capaces de formar micrometastasis mientras que otras células tumorales desaparecen (despejadas después de quedar atrapadas en el CHT).
Por lo tanto, comparando la eficiencia de la micrometastasis (a 4 dpi) cuando las células se colocaron directamente en circulación – CIRC (las células sólo tienen que pasar por los últimos pasos de la metástasis) vs. cuando no – NO CIRC (las células necesitan pasar por pasos tempranos y tardíos para poder formar una micrometastasis) podemos evaluar su potencial metastásico temprano o tardío. Hemos observado células tumorales que pueden formar eficientemente micrometastasis en el CHT en ambos grupos (CIRC y NO CIRC), lo que sugiere que estas células tienen la capacidad de someterse a todas las etapas de la cascada metastásica (SW480 y MDA-MB-468 por ejemplo)8,11. Por el contrario, otras células tumorales tienen un potencial metastásico muy bajo en ambos grupos, casi nunca haciendo micrometastasis, incluso cuando se inyectan en circulación (es decir, visibles en el CHT a 24 hpi, pero a 4 dpi ya no están allí, Hs578T por ejemplo)8. Sin embargo, hemos encontrado claramente otro grupo – uno que es solamente capaz de formar micrometastasis cuando está inyectado en la circulación (podemos observar solamente micrometastasis en el grupo de CIRC). Esto sugiere que estas células tienen una baja eficiencia en la realización de los primeros pasos de la cascada metastásica, pero por otro lado son capaces de sobrevivir en circulación, extravasar y colonizar un sitio distante.
Inmunostaining e imágenes
Antes de la fijación, este protocolo de inyección se puede utilizar para otros enfoques de imágenes en vivo como microscopía de contraste de interferencia diferencial en vivo (DIC), microscopía de disco giratorio, imágenes confocales en vivo de alta resolución y microscopía de láminas de luz, etc.
Las células muertas y los desechos celulares aparecen brillantes cuando se observan a través del estereomicroscopio fluorescente y pueden confundirse con células vivas, especialmente si el objetivo del estudio es evaluar el potencial metastásico de las líneas celulares. Quisiéramos tensionar la importancia de realizar proyección de imagen confocal con los marcadores específicos de la viabilidad y DAPI para evaluar el estado de supervivencia del tumor y del micrometastasis. Además, es fundamental utilizar anticuerpos humanos específicos para detectar células humanas como las mitocondrias antihumanas o el HLA antihumano. Al implementar el protocolo, entrene los ojos del experimentador comparando la tinción en el esteremicroscopio con las imágenes confocales. Después de algún tiempo, los experimentadores pueden distinguir claramente los desechos de las células vivas en el estereomicroscopio fluorescente.
Aunque otros métodos para cuantificar carga del tumor tales como área entera de la fluorescencia sean ampliamente utilizados, recomendamos realizar immunostaining del montaje entero y proyección de imagen confocal como método más exacto. No sólo la eficiencia de la tinción de colorantes lipofílicos es muy variable (es decir, algunas células están muy bien teñidas, mientras que otras no lo están – probablemente debido al contenido de lípidos de sus membranas), sino que también muchas veces los tintes lipofílicos forman agregados, y las células muertas tienden a ser más brillantes – creando varios artefactos que se pueden confundir con células vivas.
Las células se pueden transducir con proteínas fluorescentes para ayudar en su seguimiento y omitir el etiquetado celular. Sin embargo, asegúrese de que las células transducidas y no transducidas producen los mismos resultados en los xenoinjertos de pez cebra.
Además, los macrófagos pueden fagocitos estos restos de células fluorescentes que se etiquetan fluorescentemente y migran, generando falsos positivos en células metastásicas. Por lo tanto, recomendamos una serie de herramientas analíticas, que por supuesto se pueden extender a muchas otras lecturas para una interpretación más precisa del comportamiento del tumor:
Para una adquisición confocal con intervalo de 5 μm entre rebanadas en la pila Z de las células cancerosas control HCT116 (tamaño nuclear promedio de 10-12 μm de diámetro) con dapi counterstaining, hemos observado que ~ 50% de las células se comparten entre dos rebanadas consecutivas. Por lo tanto, si se cuenta cada sector, existe un alto riesgo de contar las mismas celdas dos veces. Ir y venir entre rebanadas para evitar problemas en la cuantificación da como resultado una técnica lenta y propensa a errores. Para facilitar la cuantificación del número total de células y permitir una mayor reproducibilidad entre los investigadores, creamos la fórmula de tamaño tumoral previamente descrita en este protocolo8.
Incluimos un número de corrección (1.5) para tener en cuenta las celdas de ~ 50% compartidas entre las rebanadas. Encontramos que el error medio de la cuenta manual del tumor entero entre los investigadores era el 20%. Dos investigadores que utilizaron la fórmula tuvieron un error del 2%. El uso de esta fórmula tiene una tasa de precisión del 93% y una tasa de reproducibilidad del 98%. También probamos métodos automatizados, pero demostraron un error superior al 50% causado por la configuración del umbral.
Debido a las características de las células apoptóticas, la cuantificación de las células caspasa 3 activadas es más difícil. Para reducir el número de errores y la variación en los resultados, se recomienda que las muestras de control y experimentales sean contadas por el mismo investigador. Además, al aprender esta técnica, un nuevo investigador debe contar imágenes que ya fueron cuantificadas por investigadores más experimentados para comparar resultados y entrenar.
La longitud del ensayo se puede ampliar si es necesario. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las larvas de pez cebra requieren alimentación viva a partir de ~ 7 días después de la fertilización (5 días después de la inyección). Además, las pautas y regulaciones de bienestar animal aplicadas a las larvas mayores de 6 días después de la fertilización pueden variar.
Este protocolo proporciona herramientas útiles para permitir que un solo investigador inyecte aproximadamente ~ 200-300 larvas de pez cebra por hora; y los resultados para el ensayo completo, incluido el análisis y la interpretación estadística, obtenidos en tres semanas. Esperamos que este protocolo pueda ayudar a los investigadores a convertirse en expertos en la generación de xenoinjertos de pez cebra. No es fácil; necesitas practicar pero llegarás allí. ¡Buena suerte!
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a la Fundación Champalimaud, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, cofinanciada por FCT/Lisboa2020) por su financiación. Becas FCT para VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Todos los miembros del Fior Lab para discusiones críticas; B. Costa y C. Rebelo de Almeida por compartir datos; y nuestros miembros del Laboratorio C. Rebelo de Almeida, M. Barroso y L. Leite por su participación en el video. Nos gustaría agradecer a cf Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al) y champalimaud comunicación, eventos y alcance equipo en particular Alexandre Azinheira para la realización de películas fantásticas y Catarina Ramos y Teresa Fernandes para su ayuda.
Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |