다이아몬드 광원에서 빔라인 I23의 진공 장거리 결정예 촬영을 위한 샘플 준비 및 전송 프로토콜

긴 파장 X 선 회절은 거시 분자에 기본적으로 존재하는 특정 광 원자의 비정상적인 산란 특성을 활용하는 데 사용됩니다. 이것은 결정적 위상 문제를 해결하고 거대 분자 내의 이러한 요소의 정체성과 위치를 명확하게 확인하는 데 도움이됩니다. 거시분자 결정학 초기에 , 드 노보 구조는 여러 개의 동종 대체에 의해 해결^{되었지만, 싱크}로트론에서 튜탈 가능한 X선 빔라인의 출현과 함께 다파장 및 단일 파장(SAD)을 기반으로 한 실험적 단계적 편곡 기술이 지배적인 방법이 되었습니다² . 두 방법 모두 역사적으로 중금속의 동종 또는 비정상적인 신호에 의존해 왔으며, 이는 조정 또는 결정적 흡수에 의해 인위적으로 결정에 도입되어야 합니다³. 시행 착오 방식과 예측할 수 없는 결과로 이러한 실험은 실망스럽게 도포할 수 있습니다. 단백질 발현 동안 셀레노 메티오닌의 통합⁴ 는 진핵 단백질 발현 시스템에서 매우 어려울 수 있지만 이러한 한계를 극복하고 짧은 파장에서 비정상적인 회절을 악용하는 매우 우아한 방법입니다.

장거리 MX는 추가 치료 없이 성공적인 결정화 시험에서 직접 결정을 사용하는 편리성 때문에 네이티브 SAD 실험에 의한 구조 결정에 매우 매력적이다^5,6. 또한 칼슘, 칼륨, 염소, 황 및 인과 같은 생물학적 중요성이 높은 요소의 흡수 가장자리에 대한 접근은 거대 분자^7,8,9,10에서 이러한 원소의 위치를 직접 식별 할 수있는 기회를 열어줍니다. 중간 및 저해상도에서, 2Fo-Fc 전자 밀도 및 화학 환경에 기초한 원소 할당은 특히 비슷한 수의 전자 또는 부분 점유율을 가진 약한 바운드 이온을 가진 원소에 대해 어려울 수 있습니다. 이러한 모호성은 결과 모델 단계적 차이 Fourier ^maps11,12의 관심 요소및 해석 요소의 흡수 가장자리 아래 및 위의 데이터를 수집하여 해결할 수 있습니다. 이 지도에서 유황 원자 위치를 찾는 것은 또한 저해상도 전자 밀도지도에 모델 구축을 도움이 될 수 있습니다¹³. 이러한 광 원소의 흡수 가장자리는 λ = 3 및 6 Å 사이의 파장에서 관찰됩니다(그림 1, 상단 참조). 이 파장 범위는 모든 싱크로트론 MX 빔라인의 기능을 훨씬 뛰어넘었으며, 이 범위의 효율적인 작동은 아래에 설명된 바와 같이 몇 가지 기술적 과제를 극복해야 합니다.

영국 다이아몬드 광원의 Beamline I23은 λ = 1.13 및 5.9 Å 사이의 파장 범위에서 조정 가능한 장거리 MX 실험을 용이하게 하기 위해 특별히 설계된 독특한 기기입니다(E = 2.1 및 11 keV 사이의 에너지 범위). 고진공 환경에서 작동함으로써 ¹⁴, 공기 흡수 및 산란이 제거되어 회절 실험의 효율성과 신호 대 잡음 비율을 향상시킵니다. 대형 진공 축전소는 반원통형 필라투스 12M 검출기, 다축 고니오미터, 온라인 보기 및 콜리메이션 시스템, 시료 이송 및 저장을 위한 맞춤형 장비 등 시료 환경의 모든 구성 요소를 둘러싸고 있다(그림 2). 각 장비는 최상의 품질의 긴 파장 데이터를 수집할 수 있도록 최적화되었습니다. 곡선 필라투스 12M 검출기는 2θ = ±100°의 회절 각도로 수집할 수 있으며, 이로 인해 가장 긴 파장에서도 충분히 고해상도 회절 데이터가 생성됩니다(그림 1, 아래쪽). 120개의 검출기 모듈은 저에너지 호환성을 위해 특별히 선택되었으며, 추가적인 초고게인 모드에 대한 교정이 제공되었습니다.

가장 낮은 검출기 임계값은 1.8 keV이며, 3.6 keV보다 낮은 에너지에 대한 코너 및 에지 효과가 증가하고, 특히 낮은 모자이시티 결정의 경우 가장 긴 파장에서 데이터 품질이 손상되는 것을 관찰할 수 있다. 이러한 효과는 검출기 양자 효율^의 감소와 함께 실험계획시 고려해야 한다. 다축 고니오미터를 사용하면 결정의 방향을 전환하여 비정상적인 신호의 품질과 강도를 극대화하는 데이터 수집 전략과 수집된 비정상적인 데이터의 완전성을 극대화할 수 있습니다. 시료 흡수는 특히 가장 긴 파장에서 실험을 제한하는 요소입니다. 흡수 보정은 일반적으로 사용되는 MX 처리 소프트웨어 패키지^16,17에서 구현된 바와 같이, 약 3Å의 파장에 잘 작동하고 있다. 더 긴 파장은 지형 재구성에 기초한 분석 흡수 보정이 필요합니다¹⁸ 또는 레이저 절제비비 비 확산 물질을 제거하고 잘 정의 된 모양으로 결정을 잘라¹⁹. 또한 더 긴 파장에서의 X선 회절 실험이 더 작은 결정¹⁴에 더 효율적이기 때문에 후자는 더 큰 결정의 크기를 줄이는 데 도움이 됩니다. 개방형 냉기 가스 스트림 장치를 사용하는 것은 진공 환경과 호환되지 않기 때문에 데이터 수집 중에 극저온 온도에서 샘플을 유지하는 과제는 전도성 냉각에 의해 해결됩니다. 따라서 구리와 같은 열 전도성 물질은 샘플을 펄스 튜브 저온쿨러에 연결하기 위해 필요합니다. MX 전반에 걸쳐 사용되는 스테인리스 스틸 SPINE 표준 핀과 상업적으로 이용 가능한 기타 시료 마운트는 열 전도도가 좋지 않아 진공 내 장파장 MX에 적합하지 않습니다.

진공 MX용 샘플 홀더(SHs)는 열 제거 열 경로의 필수적인 부분이어야 합니다(그림 3A). 따라서 열전도성 구리 본체와 핀으로 구성되며, 차가운 고니오미터 헤드에 대한 적절한 열 링크를 보장하기 위한 강력한 자석 베이스와 폴리이미드로 만든 샘플 마운트의 두 가지 중요한 특징을 포함시켜 X선 흡수 및 산란²⁰을 최소화합니다. 수정 수확 및 플래시 냉각의 사용자 경험이 표준 MX 관행과 관련된 것과 거의 동일하도록 하기 위한 노력이 이루어졌습니다. 전용 I23 SHs는 다른 싱크로트론 빔라인과 직접 호환되지 않기 때문에 스테인리스 스틸 어댑터는 다른 MX 빔라인의 수정 수확 마그네틱 지팡이 및 기존 고니오미터 인터페이스와의 호환성을 위해 사용됩니다(그림 3B). 어댑터는 ALS 형 로봇 그리퍼 헤드²¹ 및 unipuck 스타일의 기본 레이아웃²²²를 기반으로 하는 다른 다이아몬드 MX 빔라인의 자동화 시설을 사용하는 데에도 중요합니다. 샘플 준비 및 로딩 프로토콜은 다음 두 단계로 세분화할 수 있습니다.

1단계: 자신의 실험실에서 사용자가 수행한 크리스탈 수확 및 플래시 동결

I23 데이터 수집에 대한 프로젝트 적합성 평가에 따라 결정 크기와 일치하는 루프가 있는 샘플 홀더(어댑터로 미리 조립)가 수정 수확을 위해 사용자 실험실로 전송됩니다. 손상을 방지하기 위해 SHs와 어댑터는 분리되어서는 안되며 표준 크리스탈 수확 자기 지팡이를 사용하여 적절한 크기의 루프를 사용하여 낚시 크리스탈을 목적으로 한 단위로 사용되어야 합니다. MX에서 흔히 볼 수 있듯이, 이 작업은 현미경하에서 수동으로 수행되며, 결정은 액체 질소²³을 가진 거품 분해에서 즉시 플래시 냉각된다. 자기력의 불일치로 인해 SHs는 현재 유니퍽과 호환되지 않습니다. 보관 및 배송은 요청 시 사용자가 사용할 수 있는 콤비퍽( 재료 표 참조)과 호환되는 건식 발송인 인서서츠(그림 3C)를 사용하여 실현됩니다. 이 퍽은 널리 사용되는 유니퍽과 동일한 베이스 플레이트를 공유하고 다른 다이아몬드 MX 빔라인에서 시료를 빠르게 사전 검사할 수 있습니다. 맞춤형 샘플 홀더가 시판될 때까지 사용자에게 이 장비를 대여하는 것이 현재 가장 적합합니다. 빔라인으로 운송하려면 MX 커뮤니티에 사용되는 표준 건식 발송인이 필요합니다.

2단계: 저온 냉각시 샘플을 진공 종전소로 옮기

샘플이 빔라인에 도착하면 진공 종전소로 옮길 준비가 됩니다. 이것은 콤비퍽에서 SHs를 제거하고 어댑터에서 분리하는 것을 포함합니다. 진공에 생물학적 샘플을 도입하는 것은 냉동 전자 현미경 검사장에서 일상적으로 수행됩니다. 잘 확립 된 개념 중 일부는 I23 샘플 전송에 맞게 조정되었습니다. 요컨대, SHs는 액체 질소로 이송되어 이송 블록으로 전달된다(도 3D). 이 블록은 우수한 열 전도도와 상당한 열 질량을 가지고 있으며, 진공 상태에서 결정이 유리 전이 온도에 도달하지 못하게합니다. 각각 4개의 시료의 용량을 가진 최대 4개의 블록은 액체 질소 아래에 블록 퍽(그림 3H)으로 적재되며, 이는 극저온 전달 시스템(CTS)으로 샘플을 전송하거나 실험 사이의 액체 질소 디워즈에 저장하는 데 사용됩니다.

다이아몬드 광원에서 개발된 극저온 전송 시스템은 두 개의 하위 어셈블리인 샘플 스테이션과 셔틀(그림 4A)으로 구성됩니다. 샘플 스테이션은 단백질 결정의 임시 저장을 위한 액체 질소 목욕으로 구성되어 있으며 안전을 보장하고 사용자 친화적 인 경험을 할 수있는 특정 기능을 갖추고 있습니다 (그림 5). CTS는 사용자 친화적인 터치스크린 인터페이스를 통해 프로그래밍 가능한 논리 컨트롤러에 의해 제어됩니다. 샘플 스테이션에는 더 나은 시각화를 위해 내장된 발광 다이오드와 샘플이 전송된 후 액체 질소 목욕의 건조를 자동화하기 위해 근접 루프로 제어되는 히터 세트가 내장되어 있습니다. 또한 시스템의 안전과 효율적인 기능을 보장하기 위해 다양한 센서를 보유하고 있습니다. 샘플 스테이션은 시료 전송을 위해 거친 진공으로 펌핑하는 것과 같이 작업을 위해 셔틀과 상호 작용할 수있는 신뢰할 수있는 전기 인터페이스를 제공하고 액체 질소 수준 및 셔틀 내부 온도를 모니터링할 수있는 맞춤형 하드웨어를 갖추고 있습니다.

셔틀(그림 6)은 샘플 스테이션 액체 질소 욕조에서 이송 블록을 픽업하고 극저온 및 진공 환경 내부로 엔드스테이션으로 전송하는 데 사용되는 휴대용 장치입니다. 전송 중에 시료를 차갑게 유지하는 액체 질소 제war, 분해 내의 액체 수준 모니터링, 작동 및 사용자 안전을 위한 다양한 센서가 포함됩니다. 전송 팔에는 마그네틱 드라이브가 장착되어 있으며 사용자가 안전하게 하역 및 언로딩 전송 블록을 엔드스테이션으로 안내하는 가공 홈이 포함되어 있습니다. 셔틀에서 진공 용기로 의 전송은 에어록을 통해 수행됩니다. 에어록은 셔틀과 엔드스테이션 사이의 간 공간을 대피하는 데 사용되는 엔드스테이션의 셔틀 용 인터페이스로 셔틀및 엔드스테이션 진공 밸브를 엽니다. 펌핑 및 환기 시퀀스는 완전히 자동화되어 있으며 사용자 친화적인 인터페이스(그림 4C)가 있는 대형 터치스크린을 통해 작동할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 데이터 수집을 위해 타우마티드 결정을 진공 엔드스테이션으로 전송하는 데 사용됩니다.