金刚石光源下光束线I23真空长波长晶体学的样品制备和转移实验方案

长波长X射线衍射用于利用大分子中原生存在的特定光原子的异常散射特性。这有助于解决晶体相问题，并明确确认这些元素在大分子中的身份和位置。在大分子晶体学的早期，通过多个同构替换¹解决了从头结构，但随着同步加速器上可调谐X射线光束线的出现，基于多波长和单波长（SAD）异常衍射技术的实验相位已成为主要方法².这两种方法历来都依赖于来自重金属的同构或异常信号，这些信号需要通过共结晶或晶体浸泡人工引入晶体³。试错法和不可预测的结果可能会使这些实验令人沮丧地耗时。在蛋白质表达过程中掺入硒-蛋氨酸⁴是克服这些限制并利用短波长异常衍射的一种非常优雅的方法，尽管在真核蛋白表达系统中可能非常具有挑战性。

长波长MX对于通过天然SAD实验进行结构测定极具吸引力^5，6，因为直接从成功的结晶试验中使用晶体而无需进一步处理。此外，获得具有高生物学重要性的元素（如钙，钾，氯，硫和磷）的吸收边缘，为直接识别这些元素在大分子中的位置提供了机会^{7，8，9，10}。在中低分辨率下，基于2Fo-Fc电子密度和化学环境的元素分配可能很困难，特别是对于具有相似电子数或具有部分占用的弱结合离子的元素。这些模糊性可以通过收集感兴趣元素的吸收边缘下方和上方的数据并解释生成的模型相位异常差傅里叶图^{来解决11，12}。在这些图中定位硫原子位置也有助于将模型构建成低分辨率电子密度图¹³。这些光元素的吸收边缘在λ = 3和6 Å之间的波长处观察到（见图1，顶部）。该波长范围远远超出了任何同步加速器MX光束线的能力，并且在此范围内高效运行需要克服一些技术挑战，如下所述。

英国钻石光源的光束线I23是一种独特的仪器，专门设计用于促进长波长MX实验，可在λ = 1.13至5.9 Å之间的波长范围内可调（能量范围在E = 2.1和11 keV之间）。通过在高真空环境中工作¹⁴，消除了空气吸收和散射，从而提高了衍射实验的效率和信噪比。大型真空终端站包含样品环境的所有组件，包括半圆柱形 Pilatus 12M 探测器、多轴测角仪、在线查看和准直系统，以及用于样品转移和存储的定制设备（图 2）。每台设备都经过优化，以确保可以收集最高质量的长波长数据。弯曲的Pilatus 12M探测器可以收集到2θ = ±100°的衍射角，即使在最长波长下也能获得足够高分辨率的衍射数据（图1，底部）。120 个探测器模块经过专门选择，可实现低能耗兼容性，并提供额外的超高增益模式校准。

可能的最低探测器阈值为1.8 keV，对于低于3.6 keV的能量，导致角和边缘效应增加，并且在最长波长下的数据质量受损，特别是对于低镶嵌度晶体。在计划实验时，需要考虑这种效应与探测器量子效率的降低¹⁵ 相结合。多轴测角仪能够重新定向晶体，以允许数据收集策略，最大限度地提高异常信号的质量和强度，以及收集的异常数据的完整性。样品吸收是实验的限制因素，特别是在最长波长下。在常用的 MX 处理软件包 ^16，17 中实现的吸收校正在 3 Å 左右的波长下工作良好。较长的波长需要基于层析成像重建¹⁸ 或激光烧蚀的分析吸收校正，以去除非衍射材料并将晶体切割成明确定义的形状¹⁹。后者还将有助于减小较大晶体的尺寸，因为较长波长的X射线衍射实验对于较小的晶体更有效¹⁴。在数据收集过程中将样品保持在低温下的挑战通过传导冷却来解决，因为使用开流冷气流设备与真空环境不兼容。因此，需要导热材料（如铜）将样品连接到脉冲管低温冷却器。整个MX中使用的不锈钢SPINE标准引脚以及任何其他市售样品安装座都不适合真空长波长MX，因为它们的导热性差。

用于真空 MX 的样品架 （SHs） 必须是散热热通道的重要组成部分（图 3A）。因此，它们由导热铜体和引脚组成，并包括两个重要特征：坚固的磁铁底座，以确保与冷测角仪头的充分热链接，以及由聚酰亚胺制成的样品安装座，以最大限度地减少X射线吸收和散射²⁰。已作出努力，确保晶体采集和闪蒸冷却的用户体验与标准 MX 实践的用户体验几乎相同。由于专用的 I23 SC 不与其他同步加速器光束线直接兼容，因此使用不锈钢适配器与其他 MX 光束线上的晶体采集磁棒和现有测角仪接口兼容（图 3B）。如果样品变化需要快速预筛选以选择最佳衍射晶体，则该适配器对于利用其他 Diamond MX 光束线上的自动化设施也很重要，这些光束线基于 ALS 型机器人夹持器头²¹ 和单枕式底座布局²²。样品制备和上样方案可分为两个阶段：

第1阶段：收集晶体并由用户在自己的实验室中进行速冻

在评估项目是否适合I23数据收集后，将带有与晶体尺寸相匹配的环路（预组装有适配器）的样品架送到用户实验室进行晶体采集。为防止任何损坏，不应将SHs和适配器分开，并作为一个单元使用，以便使用标准水晶收集磁棒用适当大小的环捕获晶体。与MX中常见的一样，该任务在显微镜下手动执行，晶体立即在带有液氮的泡沫杜瓦瓶中闪蒸冷却²³。由于磁力不匹配，SHs目前与单气压不兼容。存储和运输是使用组合（参见 材料表）实现的，这些组合可根据用户要求与兼容的干式托运人插件一起使用（图3C）。这些圆盘与广泛使用的单气囊共享相同的底板，并允许在其他 Diamond MX 光束线上快速预筛选样品。目前，将此设备借给用户是最好的安排，直到定制的样品架在商业上可用。运输到光束线需要MX社区中使用的标准干式托运人。

第2阶段：将冷冻冷却的样品转移到真空终端站

一旦样品到达光束线，它们就准备好转移到真空终端站中。这涉及从梳子中去除SHs并从适配器中分离。在冷冻电子显微镜领域，通常将生物样品引入真空中。一些完善的概念适用于I23样品转移。简而言之，SHs在液氮下转移到转移块上（图3D）。这些块具有优异的导热性和显着的热质量，可防止晶体在真空中达到玻璃化转变温度。在液氮作用下，将多达四个块（每个样品容量为四个样品）加载到块状圆盘中（图3H），该圆盘用于将样品转移到低温转移系统（CTS）或用于在实验之间储存在液氮杜瓦瓶中。

在金刚石光源开发的低温转移系统由两个子组件组成，即样品站和穿梭机（图4A）。样品站由用于临时储存蛋白质晶体的液氮浴组成，并具有确保安全性并允许用户友好体验的特定功能（图5）。CTS由可编程逻辑控制器通过用户友好的触摸屏界面控制。样品站内置了发光二极管，以实现更好的可视化，并且一组加热器在闭环中控制，以便在样品转移后自动干燥液氮浴。它还具有各种传感器，以确保系统的安全性和高效运行。样品站具有定制的硬件，可提供可靠的电气接口，以便与穿梭车进行交互以进行操作，例如泵送至粗糙的真空以进行样品转移，以及监测穿梭车内的液氮水平和温度。

穿梭车（图6）是一种便携式设备，用于从样品站液氮浴中拾取转移块，并将其在低温和真空环境中转移到终点站。它包括液氮杜瓦瓶，用于在转移过程中保持样品低温，杜瓦瓶中的液位监控，以及用于操作和用户安全的各种传感器。传输臂配有磁力驱动装置，并包括机加工槽，可指导用户将传输块安全地装载和卸载到端站中。从航天飞机到真空容器的转移是通过气闸进行的。气闸是终点站上航天飞机的接口，用于在打开航天飞机和终点站真空阀之前疏散航天飞机和终点站之间的间隙。泵送和排气顺序是完全自动化的，可以通过带有用户友好界面的大型触摸屏进行操作（图4C）。目前的协议用于将thaumatin晶体转移到真空终端站进行数据收集。