극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

급락 동결을 위한 P. falciparum schizonts 준비 화합물 2 및 E64 억제제는 여러 출구 단계에서 분열증을 지연시키는 데 사용되어 후속 연구를 위해 풍부한 분열증 개체군을 생성합니다. 이는 상보적 상관 기술이 없으면 특정 세포 내 표적 또는 세포 유형을 밀링하는 과정이 본질적으로 블라인드이기 때문에 어렵기 때문에 중요합니다. 화합물 2는 액포 파열 전에 유출을 정지시키는 단백질 키나제 억제제입니다. Schizonts는 화합물 2에서 4시간 동안 동기화한 다음 화합물 2가 없는 배지로 세척하여 억제제를 제거할 수 있으며, 이 시점에서 schizonts는 약 30분 후에 성숙하고 배출됩니다. 대안적으로, 화합물 2 동기화된 분열체는 비가역적 광범위 시스테인 프로테아제 억제제인 E64로 세척하고, 액포 파열 지점 후, 그러나 숙주 세포 파열 전에 출구를 정지시키기 위해 약 1시간 동안 인큐베이션할 수 있습니다. 처리된 분열증의 형태와 균질성은 급락 동결 전에 Giemsa로 염색된 혈액 도말로 확인해야 합니다(그림 1). Schizonts는 이 간행물에 설명된 방법을 사용하여 이러한 상태 중 하나에서 동결될 수 있습니다. 그림 1: Giemsa로 염색된 혈액 도말에 의한 화합물 2 및 E64 스톨 P. falciparum schizonts의 형태. (A) 화합물 2의 존재 하에서, 기생 액포 (PV)는 헤모조인 결정의 단일 클러스터 (짙은 갈색 원)와 함께 메로 조이트 (보라색 원)로 조밀하게 채워진다. 숙주 적혈구(hRBC)에서 PV와 주변 헤모글로빈 사이의 경계(회색 띠)는 hRBC 막뿐만 아니라 잘 정의되어 있습니다. (B) E64가 존재할 때, PV 막은 파열되고 메로조이트는 hRBC 내에서 퍼진다. 각 분열증에는 여전히 헤모조인 결정의 단일 클러스터가 포함되어 있습니다. 숙주 세포막이 누출되고 부분적으로 붕괴되어 세포 주변부 내에서 헤모글로빈이 보이지 않으며 hRBC 막의 경계가 쉽게 보이지 않습니다. 스케일 바, 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 급락 동결 최적화금 및 구리 200메쉬 그리드에 2/2, 3/3, 3.5/1 및 5/2(정사각형) 구멍 탄소를 포함하여 P. falciparum에 감염된 적혈구에 대한 블로팅 조건을 최적화하는 동안 구멍 크기가 다른 다양한 그리드를 시험했습니다. 2/4 구멍이 뚫린 탄소 필름이 있는 200메쉬 구리 파인더 그리드는 긴 유리질 라멜라를 밀링하기에 적절하게 두꺼운 세포 층을 제공합니다. 더 크거나 작은 구멍은 일반적으로 각각 너무 얇거나 두꺼운 세포층을 생성했습니다(그림 2A-C). 2/4 구멍이 많은 탄소를 사용하면 뒤쪽(비탄소 쪽)에서 그리드를 블롯팅하여 2μm 구멍을 통해 분열자를 잡아당겨 탄소 필름 위와 아래에서 세포가 튀어나오게 합니다. 구멍 사이의 4μm 탄소 스트레칭은 대부분의 결과 라멜라의 중간을 통과하는 탄소 스트립을 생성하여 강도를 추가합니다. 파인더 그리드는 상관 및 스크리닝 목적(44)에 가장 적합하지만, 메쉬 설계의 숫자/문자가 너무 크지 않도록 주의해야 하는데, 이는 밀링을 위한 영역을 차단할 수 있기 때문이다. 수동 플런저의 블로팅 시간은 약 20초이지만, 그리드에서 추출되는 액체 방울이 여과지에 퍼지는 것을 멈췄을 때 블로팅을 중지해야 하는 정확한 지점을 눈으로 판단했습니다. 블로팅 공정을 시작하기 위해 방울의 표면 장력을 깨기 위해 찢어진 가장자리가 필요했습니다. 이 연구에서는 자동 플런지 냉동고를 사용하지 않았지만 이 샘플의 합리적인 출발점은 수동 플런저에 사용된 것과 동일한 부피의 셀과 그리드 유형을 사용하여 습도가 높은 조건(~70%)과 주변 온도(~25°C)에서 그리드를 뒤에서 블롯링하는 것입니다. 블로팅 시간과 조건은 사용되는 특정 자동화 시스템에 맞게 최적화되어야 합니다. P. falciparum schizonts의 플런지 동결 그리드는 샘플이 전자로 투과되지 않았기 때문에 TEM이 아닌 극저온 스테이지가 장착된 광학 현미경으로 스크리닝되었습니다. 더 얇은 샘플의 경우, 그리드는 cryoFIB-SEM으로 샘플을 옮기기 전에 TEM(~150x 배율의 전체 그리드 아틀라스)으로 스크리닝할 수 있으며, 이는 국가 시설에 접근하기 위한 전제 조건일 수 있습니다. 그리드 전체와 개별 그리드 사각형 내에서 얼음 두께의 구배에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 좋은 격자 사각형은 한 셀 두께이거나 중앙의 탄소 필름에 부딪혀야 합니다(그림 2C). 이렇게 하면 그리드 사각형 가장자리 주변의 그리드 막대에 대해 더 두꺼운 얼음에서 밀링되는 것을 방지하고 이온 빔이 세포층 위와 아래를 뚫고 쐐기가 아닌 자유 라멜라를 생성하도록 합니다. 재현 가능한 블로팅 및 플런지 동결 조건이 최적화되면 일반적으로 FIB 밀링 전에 스크리닝이 더 이상 필요하지 않습니다. 그림 2. 극저온 광학 현미경으로 급락 냉동 P. falciparum schizonts의 그리드에서 세포 분포를 분석합니다. (A) 초저온 현미경으로 격자 사각형을 가로질러 얼음이 너무 두꺼워서 세포와 탄소막을 가리는 예. 스케일 바, 10 μm. (B) 구멍 크기(5/2 정사각형 구멍 탄소 필름이 있는 300메쉬 구리 그리드)가 세포에 비해 너무 커서 얼음이 없는 빈 영역으로 둘러싸인 매우 얇은 생물학적 물질 층이 생성되는 예. 이와 같은 그리드는 매우 짧고 불안정한 라멜라를 생성합니다. 스케일 바, 10 μm. (C) 2/4 구멍이 뚫린 탄소 필름이 있는 200메쉬 구리 그리드에서 양호한 셀 분포의 예. 이 분열증은 E64 억제제로 치료되었습니다. 주변이 잘 정의된 큰 세포(빨간색 상자, 직경 ~5μm)는 여전히 손상되지 않은 액포 막을 가지고 있는 감염된 적혈구입니다. 작은 세포 클러스터(파란색 상자, ~1μm)는 부분적으로 붕괴된 숙주 적혈구 내에 포함된 개별 메로조이트입니다. 각 분열증은 중앙에 검은 점이 있어 헤모조인 결정의 위치를 나타냅니다(자세한 내용은 그림 1 참조). 세포 형태의 차이는 cryoFIB-SEM 내부에서 한 번 확인하기가 쉽지 않습니다. 따라서 초저온 광학 현미경에 의한 사전 스크리닝은 재현 가능한 블로팅 조건에 도달할 때까지 유용합니다. 격자 막대 옆에 있는 격자선 사각형의 모서리 주위의 셀 커버리지(흰색 점선 영역)가 너무 두꺼워서 밀링할 수 없습니다. 격자 사각형 중앙의 더 얇은 영역(노란색 점선 영역)은 라멜라를 주변 세포층으로 확장하여 밀링하기에 이상적인 장소입니다. 스케일 바, 6 μm. (D) 12시 방향과 6시 방향에 컷어웨이 섹션(검은색 브래킷) 안에 하나, 반대쪽에 두 개의 검은색 표시가 있는 cryoFIB 전용 오토그리드 림의 이미지. 검은색 화살표는 밀링 방향을 나타냅니다. (E) 그리드가 오토로더 카세트에 로드될 때 표시는 로딩 핀셋의 양쪽에 등거리에 있어야 하므로 라멜라가 스테이지의 기울기 축에 수직으로 놓이게 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 단층 촬영을 위한 cryoFIB 전용 오토그리드 림 마킹일반적으로 그리드는 취급을 용이하게 하고 강성을 제공하기 위해 밀링 전에 오토그리드 림에 클리핑되어 후속 이송 단계에서 라멜라가 손상되지 않도록 보호합니다. CryoFIB 전용 오토그리드 림은 밀링 중에 더 많은 그리드 면에 접근할 수 있도록 컷어웨이 기능으로 설계되었습니다. 길이를 따라 라멜라를 회전시켜 틸트 시리즈 획득이 진행되도록 TEM의 틸트 축에 수직인 밀링 방향을 지정하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 라멜라를 둘러싸고 있는 트렌치의 높은 벽이 그리드가 기울어질 때 생물학적 정보가 가려지지 않습니다. 일반적으로 오토그리드 림은 cryoFIB-SEM 셔틀 내에서 시각적 정렬을 돕고 나중에 TEM을 로드할 때 표시됩니다. 이 샘플의 경우 12시 방향과 6시 방향에 지워지지 않는 마커( 재료 표 참조)를 사용하여 두 개의 마크를 적용했는데, 하나는 클립 링의 컷어웨이 섹션 중앙에 있고 다른 하나는 바로 반대쪽에 있습니다(그림 2D). TEM에 로드할 때( 재료 표 참조) 두 표시가 모두 로딩 핀셋의 양쪽에서 볼 수 있어야 하며 핀셋 가장자리에 90° 정렬되어야 합니다(그림 2E). 제조업체는 이온 빔에 근접한 특정 잉크가 밀링을 방해할 수 있으므로 오토그리드 림에 새겨진 점을 사용하여 그리드를 정렬할 것을 권장합니다. 클리핑된 그리드는 극저온 스테이지를 위해 수정된 카세트를 사용하여 광학 현미경으로 스크리닝할 수 있으며, 이는 클리핑 공정이 그리드의 탄소 필름을 파괴하지 않았는지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 샘플 카세트에 따라 잘리지 않은 그리드도 밀링할 수 있지만, cryoFIB-SEM에서 TEM으로 전송하는 동안 그리드의 굽힘을 제한하면 라멜라가 파손될 수 있으므로 각별한 주의가 필요합니다. 잘리지 않은 그리드는 측면 입구 극저온 홀더를 사용하여 TEM에 로드할 수 있지만 밀링 후 클리핑을 수행하면 라멜라가 파손될 가능성이 높습니다. 유기백금 코팅유기백금 코팅은 cryoFIB-SEM에 로드된 후 하나 또는 두 그리드에서 수행됩니다. 가스 주입 시스템(GIS)의 바늘을 샘플 위의 챔버에 삽입하여 설정된 시간 동안 가열된 소스에서 그리드 표면을 가로질러 유기백금 증기의 흐름을 유도합니다. 증기는 차가운 표면에 응축되어 고체 층(~2μm 두께)을 형성합니다. 이 코트의 무결성은 균일하게 얇은 라멜라를 밀링할 수 있도록 하는 데 중요합니다. 유기백금 코팅의 최적 적용 조건은 일반적으로 기기 제조업체에서 미리 결정하지만 일부 최적화가 여전히 필요할 수 있습니다. 대부분의 시스템은 챔버의 포트 형상과 스테이지의 회전 한계에 따라 GIS 바늘을 밀링 방향에 가깝게 정렬하거나 밀링 방향에 수직으로 정렬합니다. 그리드를 코팅하고, 작은 영역을 밀링하고, 스테이지를 기울이고, SEM으로 코팅 두께를 측정하여 다양한 설정을 시도할 수 있습니다. cryoFIB-SEM 자체의 설정뿐만 아니라 1) 시료의 지형, 2) 그리드의 표면 오염, 3) GIS 바늘에서 나오는 증기 흐름의 재현성 등 여러 가지 요인이 유기백금 코팅의 적용에 영향을 미칠 수 있습니다. GIS 흐름이 방향성이기 때문에 고르지 않은 지형으로 인해 세포 그림자 또는 표면 오염의 영역이 코팅되지 않거나 더 얇은 코팅을 가질 수 있습니다. 이로 인해 연마 중에 유기 백금 층이 붕괴 될 수 있습니다 (그림 3). 밀링할 영역을 선택할 때 주변 지형을 염두에 두어야 합니다., 예를 들어, 큰 표면 오염, 셀 덩어리 또는 그리드 표면에서 몇 개의 그리드 사각형만큼 튀어나온 부서진 탄소는 증기 흐름을 차단하여 라멜라를 약화시킬 수 있는 더 얇은 유기백금의 그림자를 만들 수 있습니다. 또한 라멜라의 앞쪽 가장자리 근처에 있는 매우 작은 표면 오염 입자도 밀링 중에 튀어나와 연마 중에 라멜라에 구멍이 생길 수 있는 약화된 베어 아이스 패치를 남길 수 있으므로 피해야 합니다. 마지막으로, 밀링이 시작되고 유기백금 코팅이 불안정해 보이면 다시 코팅하여 더 오래 사용하거나 백업 그리드로 교체합니다. 그림 3: 양질의 유기백금 코팅은 얇고 고르게 분쇄된 라멜라를 얻는 데 중요합니다. (A) 유기백금 코팅(OP, 노란색)이 너무 얇게 도포되어 연마 중에 발생한 라멜라 앞쪽 가장자리에 구멍(녹색 원)과 라멜라의 전체 너비에 걸쳐 고르지 않은 밀링(줄무늬)이 생긴 라멜라의 앞쪽 가장자리의 현미경 사진. 유기백금 표면은 이온 빔에 의해 잘려져 코팅의 앞쪽 가장자리 뒤에 재료가 분사됩니다(노란색 점선). (B) 유기 백금 코트 (OP)가 더 두껍게 도포되어 더 고르게 얇은 라멜라가 생성됩니다. 외투의 완전성은 라멜라의 전체 폭에 걸쳐 보존되며, 유기백금 외피와 유리화된 생물학적 물질 사이의 계면은 잘 정의되어 있습니다(노란색 점선). 탄소층은 라멜라(주황색)의 후면을 통과하는 것을 볼 수 있습니다. 스케일 바, 1 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. cryoFIB-SEM의 그리드 품질 평가 및 밀링 공정그리드가 cryoFIB-SEM으로 전송되면 탄소 필름의 무결성과 그리드의 세포 분포를 SEM으로 스크리닝 할 수 있습니다 (그림 4A-C). 얼음 구배, 그리드 막대의 위치 및 파인더 그리드의 그리드 번호 위치는 30kV의 저배율 SEM으로 확인할 수 있지만(그림 4B), 고배율에서 밀링 위치를 찾고 밀링 공정을 모니터링하여 표면 지형과의 대비를 높이는 동안 전압을 다시 5kV로 줄여야 합니다. 그림 4 : cryoFIB-SEM에서 그리드 품질 평가 및 밀링 영역 찾기. (A) SEM을 통한 5kV의 그리드의 저배율 개요. 오토그리드 테두리의 잘라낸 부분은 이미지 하단에 표시됩니다. 스케일 바, 0.5mm. (B) SEM에 의한 30kV의 동일한 그리드, 더 두꺼운 얼음(더 어두운 그리드 사각형)과 더 얇은 얼음(더 밝은 그리드 사각형)의 영역을 보여줍니다. 삽입된 부분에는 상자의 영역이 표시되며 화살표는 30kV에서 볼 수 있는 파인더 그리드의 번호를 나타냅니다. 스케일 바, 0.5mm. (C) 탄소 필름의 셀 분포와 그리드 막대의 위치를 평가하는 두 개의 그리드 사각형에 대한 중간 배율 개요. 스케일 바, 50 μm. (D) 고배율에서 첫 번째 절단을 위한 밀링 패턴의 배열(1.5 pA 및 30 kV에서의 이온 빔 보기). 빨간색 영역(두께 3μm)은 보호되고 노란색 영역은 이온 빔에 의해 제거됩니다. 흰색 점선은 최종 라멜라의 위치를 나타냅니다. 스케일 바, 10 μm. (E) 연마된 200nm 두께의 라멜라(폭 10μm x 길이 15μm)의 SEM을 통해 3kV에서 고배율 보기. 3kV에서 라멜라 내의 대비 손실은 적절한 두께에 도달했음을 나타냅니다. 밝은 흰색 전면 가장자리는 밀링 전에 GIS를 통해 그리드에 적용되는 나머지 유기 백금 층입니다. 스케일 바, 5 μm. (F) 30 kV 및 1.5 pA에서 이온 빔을 사용하여 본 (E)로부터의 동일한 라멜라. 검은색 사각형(흰색 화살표)을 가로지르는 가는 흰색 선은 라멜라의 맨 앞쪽 가장자리에 남아 있는 유기백금 코트입니다. 스케일 바, 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 밀링할 영역은 이온 빔 보기에서 고배율(schizonts의 경우 ~7,000x)로 보호 영역의 양쪽에 한 쌍의 직사각형 패턴을 배치하여 선택합니다(그림 4D). 표면 오염 입자가 밀링 영역 근처에 부착되지 않는 것이 중요한데, 이는 보호용 유기백금 코팅의 적용을 방해할 수 있기 때문입니다. 또한 이 지역의 지형이 최종 두께에 도달하면 라멜라의 측면을 지지하기에 적합해야 합니다. 말라리아 분열증(세포 크기: 직경 ~5μm x 두께 2μm, 디스크 모양)의 경우 너비 7-20μm 사이의 라멜라를 분쇄할 수 있습니다. 세포층이 적당히 두꺼우면 라멜라는 일반적으로 길이가 ~10-15μm가 되어 탄소층 위와 아래의 여러 세포를 포착합니다(그림 4E-F). 8시간 세션(밀링 6-7시간 및 연마 1-2시간)에서 5-10 라멜라를 밀링할 것으로 예상할 수 있습니다. 이것은 샘플의 두께와 라멜라의 너비에 따라 달라지며, 샘플이 두꺼울수록 라멜라가 넓어지면서 밀링하는 데 시간이 더 오래 걸립니다. 손상된 그리드도 라멜라 세트를 생성하는 데 소수의 좋은 그리드 사각형만 필요하기 때문에 밀링할 수 있습니다(그림 5A). 추가로, 샘플이 예상보다 얇은 경우, 예를 들어, 배양물의 헤마토크릿의 오버-블로팅 또는 변동으로 인해, 더 짧은 라멜라는 비교적 빠르게 분쇄될 수 있고; 그러나 길이가 짧을수록 TEM에서 데이터 수집에 사용할 수 있는 영역이 제한됩니다(그림 5B). 그림 5: 밀링 중 최종 라멜라 두께에 도달한 시점 확인 . (A) 클리핑 중 탄소 손상을 보여주는 5kV에서 SEM에 의한 그리드의 저배율 개요. 손상되지 않은 영역에는 과도한 블로팅으로 인해 매우 얇은 샘플이 포함되어 있습니다. 그러나 CryoFIBSEM에서 하루 종일 이 그리드(흰색 점선 윤곽선 내 영역)에서 6개의 라멜라를 밀링하는 것은 여전히 가능했습니다. 스케일 바, 0.5mm. (B) 이 그리드(3kV에서 SEM)에서 생성된 짧은 라멜라(폭 ~10μm x 길이 3μm, 유기백금층 제외)는 여전히 틸트 시리즈를 수집할 수 있는 두 영역을 제공했습니다. 스케일 바, 25 μm. (C) 최종 연마 단계 동안 라멜라의 일련의 SEM 이미지 (3 kV)는 라멜라가 얇아짐에 따라 (왼쪽에서 오른쪽으로 이동) 라멜라에서 대비가 어떻게 손실되는지 보여줍니다. 모든 이미지에서 라멜라 중앙을 가로지르는 짙은 검은색 선은 그리드의 탄소 필름 스트립입니다. 이 영역 앞의 세포는 탄소막 위에서 유리화되었고 이 영역 뒤의 세포는 탄소막 아래에서 유리화되었습니다. 라멜라 앞쪽 가장자리의 왼쪽에 있는 유기백금 코팅이 구조적 무결성을 잃을 뻔했을 때 밀링이 중단되었습니다. 이 정지 지점은 전체 라멜라가 균일한 두께가 되기 전이었기 때문에 라멜라 후면에 여전히 더 높은 대비 물질이 있습니다. (D) (A)에 도시된 그리드 상에서 밀링된 라멜라에 기초한 연마 경로의 예. 연마 경로는 FIB 소스에 가까운 라멜라에서 시작하여 FIB 소스에서 멀어지면서 라멜라 표면에 밀링 된 재료의 재 침착을 제한해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 연마하는 동안 라멜라의 최종 두께는 밀링되는 영역의 샘플 구조, 유기백금 코팅의 무결성 및 사용 가능한 시간에 따라 달라집니다. 이상적으로, 샘플은 3kV에서 SEM에 의해 라멜라의 전체 표면에서 대비가 손실될 때까지 얇아져야 하며, 이는 샘플이 고르게 전자 투명하고 두께가 약 150-200nm임을 시사합니다(그림 5C). 그러나 유기백금층에 구멍이 생기거나 라멜라가 구부러지기 시작하면 이 시점 이전에 밀링을 중지해야 할 수도 있습니다. 이 경우 라멜라는 여전히 앞쪽이 충분히 얇을 수 있으며 단층 촬영에 유용 할 수 있습니다. 반대로, 라멜라가 안정적으로 보이면 대비 손실 단계를 지나 얇아질 수 있으며, 밀링 패턴을 더 가깝게 이동하여(~100nm 이하) 더 얇게 만들 수 있습니다. 이는 다운스트림 워크플로에 필요한 경우 두께에 따라 달라집니다. 저배율 SEM 이미지는 이온빔 소스에 더 가깝게 시작하여 멀리 떨어진 곳에서 연마 경로를 계획하는 데 필요합니다(그림 5D). 연마 경로의 방향은 이미 완료된 라멜라에 절제된 재료가 재침착되는 것을 방지하는 데 중요합니다. 틸트 계열 데이터 수집 및 처리TEM에 로드되면 저배율 풀 그리드 몽타주(~150x)가 라멜라의 위치를 식별하며, 이는 밀링이 끝날 때 촬영한 저배율 SEM 이미지와 상관 관계가 있을 수 있습니다. 급락 냉동 분열증의 경우 대부분의 그리드가 전자에 투명하지 않으므로 라멜라 위치는 검은색 배경에 흰색 노치로 나타납니다(그림 6A). 현미경의 기울기 축에 대한 라멜라의 각도는 수직에서 ~10° 이상 떨어져 있으면 기울기 시리즈 획득이 어려울 수 있으므로 주의해야 합니다. 각 라멜라의 위치에 있는 중간 배율 몽타주(~1,500x)는 생물학적 함량에 대한 개요를 제공하고 전달 손상, 결정질 얼음 또는 과도한 표면 오염을 확인합니다(그림 6B-D). 또한 표면 오염이 획득 또는 초점 영역을 가리지 않도록 높은 기울기에서 확인해야 합니다. 획득 영역을 선택하는 것은 생물학적 특징뿐만 아니라 주변 지역의 얼음의 구조적 무결성, 예를 들어 균열을 피하는 것, 이러한 영역이 표류하거나 라멜라가 다양한 두께를 갖는 과도한 커튼이있는 영역에 따라 달라집니다. 틸트 시리즈를 획득하기 전에 그리드에 ±10° 사전 틸트가 적용되어 라멜라(그리드가 아님)의 평면을 광축에 수직으로 만듭니다. 사전 기울기의 방향은 중간 배율 몽타주에서 라멜라의 앞쪽 가장자리 위치 (유기 백금 코트 위에 남은 것을 찾음)에 의해 결정될 수 있습니다. 여기에 사용된 TEM(300kV Titan Krios)의 경우 라멜라의 앞쪽 가장자리가 지도에서 위를 가리키면 +10° 사전 기울기가 필요하고 아래를 가리키면 -10° 사전 기울기가 필요했습니다. 각 그리드는 핀셋에서 집어 들고 오토로더에 삽입된 방향으로 인해 다를 수 있습니다(컷어웨이 섹션이 왼쪽 또는 오른쪽을 향하고 180° 회전). 마지막으로 고려해야 할 사항은 픽셀 크기입니다. 일상적으로, 틸트 시리즈는 관심 있는 특징의 크기, 결과 단층 촬영 데이터의 목표 해상도 및 획득 영역의 크기를 제한할 수 있는 라멜라의 표면적을 고려하여 약 2.5-7 Å/픽셀로 수집됩니다. 고해상도 정보를 얻기 위해 더 작은 픽셀 크기를 사용할 수 있으며 이러한 샘플에서 성공적으로 사용한 가장 작은 픽셀은 1.4Å/픽셀입니다(데이터는 표시되지 않음). 드리프트는 더 작은 픽셀 크기에서 더 분명하며 연구에서 해상도를 최대화하는 것이 중요한 얇은(<100nm) 라멜라에만 적합합니다. 그림 6: 틸트 시리즈를 획득할 접근 가능한 관심 영역 선택(A) 검은색 배경에 6개의 흰색 노치(빨간색 화살표)로 나타나는 라멜라가 포함된 영역을 보여주는 저배율 TEM 맵의 섹션입니다. 흰색 사각형은 깨진 탄소 필름입니다. (B) 손상되고 실투된 라멜라의 중간 배율 지도. 라멜라(FE)의 앞쪽 가장자리에서 유기백금 코트가 벗겨졌습니다(1). 라멜라 중앙에 투명한 결정질 얼음 조각이 있습니다(2). 이온 빔은 격자 막대 옆에 얼음이 너무 두껍기 때문에 라멜라(BE)의 뒤쪽 가장자리를 뚫지 못했습니다. 라멜라의 작은 부분만이 BE(3)에서 주변 얼음이 없어 쐐기를 만듭니다. 두께로 인해 선반이 라멜라 (4) 위로 절단되어 TEM에서 높은 기울기에서 셀의 시야를 차단할 가능성이 큽니다. (C) TEM에서 본 전체 라멜라의 중간 배율 몽타주. 라멜라에서 틸트 시리즈를 채취할 때 피해야 할 일반적인 문제 또는 영역은 표면 오염(SC)으로 덮인 영역, 유기백금 코팅으로 덮인 영역(OP, 노란색), 균열 근처(CR 및 검은색 화살표), 생물학적 물질의 밀도 변화로 인한 커튼(CU 및 파란색 브래킷 내 영역) 및 유기백금 코트의 파손으로 인해 약화된 영역(녹색 원)입니다. 틸트 시리즈 획득을 위해 액세스할 수 있는 유일한 영역은 두 개의 검은색 점선 상자(1 및 2로 표시됨) 내의 영역입니다. 표면 오염이 관심 영역이나 초점 영역을 가리지 않도록 높은 기울기에서 보기를 확인해야 합니다. (D) 훨씬 더 깨끗한 라멜라의 중간 배율 몽타주이지만 연마하는 동안 유기 백금 코트 (녹색 원)가 얇아져 발생하는 균열 (CR)이 여전히 있습니다. 여기서 관심 영역은 라멜라 내에서 관찰되는 세포 유형에 의해 강조 표시되며, 이 경우 라멜라 후면(검은색 점선 상자)을 향한 탄소층(주황색) 뒤에 위치한 개별 메로조이트입니다. 스케일 바, 3 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 7: FIB 분쇄 라멜라에서 cryo-ET 데이터 수집. (A) 최근에 P. falciparum merozoite에 의해 침범된 적혈구를 포함하는 라멜라 영역의 현미경 사진. (B)에서 동일한 이미지에는 적혈구(빨간색)의 경계를 보여주기 위해 주석이 달려 있으며, 다수의 이중벽 세포내 소포(각각 내막과 외막에 대해 보라색 및 파란색) 및 숙주세포로부터 유래된 제2막(노란색)으로 둘러싸인 메로조이트(녹색)가 있다. 블랙 박스는 틸트 시리즈가 획득 된 영역을 보여줍니다. 스케일 바, 500 nm. (C) 메로조이트의 정점 끝에서 획득한 8x 빈 단층 촬영(2.4Å/픽셀)에서 XY 평면에서 본 평균 20개의 중앙 슬라이스와 (D) 주석에서 세포를 둘러싸고 있는 2개의 막(녹색 및 노란색)과 전자 밀도가 높은 버섯 모양의 특징(보라색)과 관련된 메로조이트(파란색)의 정점에 쌓인 4개의 막. 빨간색 화살표는 정점에 있는 멤브레인 스택과 버섯 모양의 특징(부분 F, i에도 표시됨)의 접합부를 나타냅니다. 검은색 화살표는 메로조이트 원형질막과 기생충 내의 다층 소포 중 하나 사이의 융합 사건을 나타냅니다(파트 F, ii에도 표시됨). 숙주 적혈구막이 도시되고(빨간색) 검은색 점선은 (E)에 표시된 XZ 평면에서 본 단면의 위치를 나타냅니다. 단면(E)의 특징은 부분(D)과 동일하게 색상이 지정되고 레이블이 지정되며 색상이 지정된 화살표가 멤브레인을 가리킵니다. 검은색 화살표는 밀링 후 라멜라에 적용된 스퍼터 코트의 위치와 표시된 라멜라의 두께를 나타냅니다. 부품용(C-E), 스케일 바, 500 nm. (F) 부분(C)에서 빨간색 및 검은색 화살촉으로 표시된 특징에 대한 보다 자세한 보기로, 메로조이트(i)의 정점에 있는 막 스택의 지질 이중층의 정의와 다층 소포와 메로조이트 원형질막 사이의 융합 이벤트를 보여줍니다. 스케일 바, 75 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 작업의 주요 초점은 메로조이트 탈출 경로를 해부하는 것입니다. P. falciparum 그러나 연구에 사용 된 세포의 집단이 결코 완전히 균질 할 수 없다는 점을 감안할 때, 종종 라멜라 내에서 세포 발달의 다른 단계가 관찰되었다. 여기에 표시된 예제(그림 7)에는 최근에 침입한 적혈구가 포함되어 있습니다. P. falciparum 기생충 (merozoite). 사용된 라멜라는 두께가 240nm이고 그리드는 TEM에 삽입되기 전에 아르곤 분위기에서 백금으로 가볍게 스퍼터링되어 일반적으로 예상되는 것보다 약간 낮은 대비를 보였습니다. 적혈구막은 세포를 둘러싸고 있는 전체를 추적할 수 있습니다. 적혈구 내에는 3개의 밀폐된 막 결합 구조, 2개의 소포가 있으며, 각각은 이중 막과 전구 모양의 특징(가장 넓은 부분에서 1.2μm x 0.9μm)으로 둘러싸여 있으며, 이는 메로조이트(그림 7A-B). 두 소포의 내용물은 적혈구의 내용물과 대조적으로 유사한 것으로 보이며, 이는 이 소포가 헤모글로빈을 함유할 수 있음을 시사합니다. 침습 후 숙주 적혈구 내 소포의 존재는 이전에 관찰되었습니다45. 그들은 침입 중에 숙주 적혈구로 배출되는 메로조이트(merozoite)의 로프리(rhoptries)라고 하는 분비 소기관으로부터 지질 및 기타 독성 인자의 분비로 인해 발생하는 것으로 생각됩니다. 메로조이트는 두 개의 밀접하게 연결된 막으로 둘러싸여 있으며, 그 중 가장 안쪽은 아마도 눈에 보이는 표면 코팅이 없는 메로조이트의 천연 원형질막일 것이며, 가장 바깥쪽은 메로조이트가 침입할 때 메로조이트를 감싸는 숙주 적혈구막에서 파생되어야 합니다. 메로조이트의 세포질은 많은 다층 소포와 정점의 막 스택에 인접한 전자 밀도가 높은 버섯 모양의 특징을 포함합니다. 이 영역(2.4 Å/픽셀)에서 획득한 틸트 시리즈에는 버섯 모양의 특징(그림 7C-E). 놀랍게도, 이 형태는 성숙한 메로조이트의 정점 끝에 있는 세포 소기관 및 세포 구조의 정상적인 배열과 상당히 다릅니다. 이를 평가하기 위해, 플런지 동결 및 밀링 전에 E64로 처리된 schizont로부터 성숙한 merozoite의 정점 말단에 대한 비교 틸트 시리즈(2.74Å/픽셀)를 얻었습니다(그림 8). 이것은 메로조이트의 정점 끝이 세포의 정점 끝에 있는 3개의 극 고리 세트 안에 자리 잡고 있고 마이크로네메라고 하는 여러 개의 작은 분비 소기관으로 둘러싸인 로트리라고 하는 두 개의 두드러진 곤봉 모양의 분비 소기관을 포함하고 있음을 보여줍니다. 가장 안쪽의 극성 고리는 침입을 유도하는 운동 단백질을 포함하는 내막 복합체라고 하는 메로조이트 원형질막의 기초가 되는 이중막 구조에 부착되어 있습니다. 침입하는 동안 분비 세포 기관의 내용물이 메로조이트 표면과 숙주 적혈구로 배출되어 메로조이트가 숙주 적혈구에 부착되는 것을 촉진하고 침습을 유도하는 운동 복합체를 시작하는 것으로 나타났습니다45. 여기의 데이터는 침입 후 메로조이트에 rhoptries, micronemes 또는 극성 고리와 유사한 관찰 가능한 구조가 포함되어 있지 않음을 보여주며, 이는 메로조이트의 정점 끝의 형태가 극적으로 변한다는 것을 시사합니다. 침입 이전의 rhoptries 융합은 이전에 고정된 실온 섹션의 TEM에 의해 나타났습니다46, 이는 침공 후 상태 메로조이트에서 관찰되는 버섯 모양의 특징의 생산과 일치합니다. 이 특징에 연결된 멤브레인 스택은 이전에 관찰된 적이 없으며 새로 침입한 메로조이트에 IMC가 존재한다는 징후가 없기 때문에 멤브레인 스택이 침공이 완료된 후 남은 IMC 기계의 잔해일 수 있다는 가설을 세웠지만 이것은 확인되지 않았습니다. 그림 8: FIB 분쇄 라멜라의 cryo-ET에 의한 성숙한 메로조이트의 정점 말단과 플라스틱 섹션의 TEM. (A) 230nm 두께의 라멜라에서 8x 빈 단층 촬영(2.74Å/픽셀)에서 평균 20개의 중앙 슬라이스가 성숙한 메로조이트의 정점 말단의 전형적인 형태를 보여줍니다. schizonts는 급락 동결 전에 E64로 처리되었으므로 PV 막이 파열되고 메로 조이트가 숙주 적혈구 내에 포함됩니다. (B)는 (A)에서와 동일하지만, 숙주 적혈구막(RCM, 빨간색), 메로조이트 원형질막(녹색), 내막 복합체(IMC, 보라색), 극성 고리(PR, 검은색), 미크로네메(M, 노란색), 로프트리(R, 회색) 및 핵외피(NE, 파란색)를 나타내는 주석이 있습니다. 이 단층 촬영 영역에서 평면을 벗어난 인접한 merozoite는 녹색 삼각형으로 표시됩니다. 스케일 바, 200 nm. (C) cryoET에 의해 관찰된 세포 특징은 플라스틱 섹션에 보존된 분열증의 TEM의 특징과 일치합니다. 유사한 세포 특징이 화합물 2로 처리된 분열증의 성숙한 메로조이트에서 나타나며, PV 막 파열 전에 출구를 멈춥니다. 스케일 바, 500 nm. (D) 부분(A-C)의 세포 특징을 보여주는 메로조이트의 주석이 달린 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 직사각형 밀링 패턴 사이의 보호 영역의 두께(μm) 30kV에서 공칭 이온 빔 전류(pA) 3 300 1.5 100 0.75 50 0.3 30 0.2 – 0.06 (최종 연마) 30* 표 1: 얇은 라멜라를 생산하기 위한 밀링 전략. 스텝-와이즈 밀링은 보호 영역의 두께에 대응하는 이온빔 전류를 감소시킴으로써 수행된다. 이는 시료 가열을 제한하여 실투를 방지합니다. *연마는 양쪽에서 라멜라에 고르게 열을 가하여 최종 두께에 도달할 때 라멜라가 구부러지거나 휘어질 위험을 줄이기 위해 병렬로 수행해야 합니다. 다른 단계는 다음 빔 전류로 이동하기 전에 라멜라 위와 라멜라 아래에서 패턴을 밀링하여 순차적으로 수행할 수 있습니다. 밀링 위치를 찾기 위해 그리드를 조사하는 것은 샘플 가열을 최소화하기 위해 1.5pA 빔 전류에서 수행해야 합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.