Подделка генов с помощью CRISPR/Cas9 и сортировка клеток в макрофагах и Т-клеточных линиях

Иммунные клетки имеют решающее значение для защиты от патогенов. Как врожденный, так и адаптивный иммунитет необходимы для клиренса инфекционных веществ и поддержания тканевого гомеостаза^1,2. Модели клеточных линий являются важными инструментами для понимания молекулярных основ иммунной системы млекопитающих; они используются в функциональных анализах in vitro, таких как те, которые моделируют активацию Т-клеток человека, и в определении функции генетических факторов в активации или ослаблении иммунных реакций^3,4. Важно отметить, что иммунная система млекопитающих чрезвычайно неоднородна и, что не менее важно, огромное количество молекул контролирует дифференцировку, миграцию и функцию данной клетки типа^5,6.

Кластеризованные регулярно интерширидные короткие палиндромные повторы (CRISPR) / Cas9 инструменты редактирования генома позволяют проводить генетические манипуляции с конкретными типами клеток, что облегчает функциональную аннотацию генов точным образом^7,8. Несколько опубликованных протоколов описали доставку CRISPR/Cas9 в виде Cas9-направляющих комплексов РНК, известных как рибонуклеопротеины (РНК) в клетках HEK293, клеточных линиях Юрката, первичных Т-клетках^9,10,макрофагах^11,12,13,стволовых клетках¹⁴и других^15,16. В этих протоколах маркировка генов обычно достигается путем слияния флуоресцентной метки с эндогенными белками^17,18. Однако было предпринято несколько попыток использовать двойные флуоресцентные репортеры, которые совместимы с сортировкой одиночных клеток, для облегчения экспериментов^19,20,особенно в иммунных клетках.

Углубленный механистический анализ, направленный на понимание функций нового генетического фактора в иммунных клетках, обычно требует специфической делеции гена клеточного типа, генетических спасательных экспериментов и, в идеале, идентификации его интеракторов. Несмотря на^то,что методы оптимизации генетической делеции генов в иммунных клетках были опубликованы^9,15,21,было зарегистрировано гораздо меньше методов введения аллелей с универсальными функциями для понимания иммунного ответа. Поэтому в этом протоколе мы стремимся подробно описать эффективный и высоко воспроизводимый протокол для экспрессии интересующего белка (POI) в локусе безопасной гавани Rosa26 как в человеческих, так и в мышиных иммунных клеточных линиях. Мы разработали двухцветную репортерную систему для обогащения клеток, трансфектерированных плазмидами, экспрессирующими CRISPR/Cas9 (DsRed2) и рекомбинантным шаблоном ДНК (EBFP2), который может быть выделен путем сортировки клеток. Следуя этому протоколу, мы получили несколько линий Т-клеточной линии человека Jurkat и мышиного макрофага RAW264.7 для функционального анализа плохо изученных белков.

В качестве примера мы покажем в этом протоколе, как получить детонирующие макрофаги RAW264.7, стабильно экспрессирующие ACE2 человека (рецептор SARS-Cov-2)^22. Поскольку врожденные иммунные клетки участвуют в патогенезе Covid-19^23,24 и ace2 человека рассматривается как основной рецептор, необходимый для проникновения вируса в клетки перед репликацией, макрофаги с подделкой ACE2 человека могут служить полезным инструментом для механистических исследований размножения вируса внутри макрофагов. Параллельно мы также представляем пример выбивания гена в локусе ROSA26 человека для экспрессии белка RASGRP1, который был слит на его аминоце с аффинным Twin-Strep-tag (OST). Т-клетки являются ключевыми клетками-мишенями в иммунной терапии, и все большее число исследований сосредоточено на манипулировании их реакцией на рак^25,26. Поскольку Rasgrp1, как известно, является ключевой сигнальной молекулой после рецептора Т-клеток, а его интеракторы недостаточно хорошо выяснены^27,модель ОСТ-RASGRP1 обеспечивает основу для идентификации интеракторов, регулирующих реакцию Т-клеток на опухоли и инфекцию. Взятые вместе, эти инструменты могут быть использованы для исследований Covid-19 и открытия новых молекул, взаимодействующих с Rasgrp1.