使用高细胞密度生物反应器通过实时定量细胞内 NMR 监测人细胞中蛋白质-配体相互作用

1. 试剂和溶液设置 为了制备完整的DMEM，将5 mL L-谷氨酰胺200mM，5mL青霉素链霉素100x和50mL胎牛血清（FBS，10%vol /vol终浓度）加入440mL DMEM。注意：该溶液可以在4°C下储存1个月。 通过将150mg低凝胶琼脂糖溶解在85°C的10mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中以获得1.5%（w / v）溶液来制备琼脂糖溶液。通过用0.22μm过滤器过滤灭菌。在1.5mL封盖管中制备1mL等分试样的琼脂糖溶液，并储存在4°C。 准备生物反应器培养基。 将13.4克DMEM粉末溶解在1升超纯H2O中。注意：根据应用的不同，所需的最终体积可能会有所不同（例如，对于500 mL培养基，将6.7 g粉末溶解在500 mL H 2 O中）。 加入 2% FBS、10 mM NaHCO3、1x 青霉素-链霉素 （100x） 和 2% D2O（例如，对于 500 mL 培养基，加入 10 mL FBS、0.4 g NaHCO3、5 mL 青霉素-链霉素 100x 和 10 mL D2O）。 使用pH计测量pH值，如果需要，通过添加HCl调节至7.4。注意：通常，初始pH值非常接近7.4。 在无菌的250 mL或500 mL玻璃瓶中，用真空驱动的无菌过滤器过滤生物反应器介质。 在层流罩中，用带有两个软管喷嘴的无菌钢头密封瓶子，并将它们连接到FEP管（o.d. = 1/8“，i.d. = 1.6 mm），该管将连接到泵和0.22μm PTFE注射器过滤器用于进气。 2. 生物反应器设置 使用第二个流动单元 NMR 管组装流动单元，该流动单元稍后将被包含细胞的 NMR 管替换。有关正确的装配，请参阅流量单元操作说明。注意：此时应已清洁流动装置（如果没有，请执行步骤 4.2）。 将连接到流量单元的水浴温度控制设置为37°C。 将储液瓶放入水浴中。 将储液瓶的 FEP 管连接到泵。 转动生物反应器阀以“旁路”并用介质预填充泵。 转动生物反应器阀“流动”，并用0.1 mL / min的培养基预填充生物反应器。 3. 细胞样品的制备 从CO2 培养箱中收集细胞。 从CO2 培养箱中取出转染HEK293T细胞的T75瓶，并取出用过的培养基。 在室温（〜20°C）下用7mL（每个）PBS洗涤细胞两次。 使用2毫升胰蛋白酶/ EDTA分离细胞。加入溶液后，在室温下孵育5分钟以分离细胞。注意：转染的细胞可能需要稍长的时间才能脱离。如有必要，将细胞在37°C孵育。 用20 mL完全DMEM灭活胰蛋白酶;通过上下移液彻底重悬细胞，并将其转移到50mL离心管中。 在室温下以800× g 离心细胞5分钟并弃去上清液。 在室温下用10mLPBS洗涤细胞以除去残留培养基。 在室温下以800× g 离心细胞5分钟并弃去上清液。 将细胞沉淀转移到1.5mL封盖的微量离心管中。 将细胞嵌入琼脂糖线中。 在水浴中在85°C下熔化一等分试样的凝固琼脂糖，然后将其保持在块加热器中以37°C的溶液中。 使用巴斯德移液器，用60-70μL的1.5%琼脂糖凝胶填充流动单元NMR管的底部，并将其置于冰中。这将产生一个~5 mm高的底部插头，允许将细胞样品放置在 1H NMR线圈的活性体积内。 在37°C下加热步骤3.1.8中获得的细胞沉淀，在热块中加热15-20秒。 将细胞重悬于450μL琼脂糖溶液中。小心避免形成气泡。 将细胞琼脂糖悬浮液吸入~30厘米长的色谱PEEK管（i.d. = 0.75 mm）中，连接到1mL注射器。注意：在抽吸之前，管子和注射器的死体积应在室温下预先填充PBS，以避免形成气泡。卡套管的长度并不重要。 让管道在室温下冷却2分钟。 在室温下用100μLPBS预填充流动单元NMR管。 通过轻轻推动注射器，将嵌入琼脂糖中的细胞线投射到流动单元NMR管中。注意：要均匀地填充 NMR 管，首先将 PEEK 管的末端放在 NMR 管的底部，然后向顶部缓慢左右摆动。 重复步骤3.2.5，3.2.6和3.2.8，直到所有细胞琼脂糖悬浮液都已投出。 将细胞插入生物反应器中。 从流动装置中取出空的NMR管，并将流速增加到2 mL / min几分钟，以除去进气管中的残留气泡。 将流速设置为0.2 mL / min，并通过缓慢但稳定地向上推动它来插入含有细胞的NMR管。注意：介质的主动流动避免了管内物品通过入口的回流，否则在插入过程中会发生这种情况。 4. 生物反应器操作和清洁 核磁共振实验期间的生物反应器操作。 将 NMR 光谱仪中的温度设置为 310 K。 将流量单元插入光谱仪。 在整个细胞内 NMR 实验期间，以 0.1 mL/min 的流速供应生物反应器培养基。 在实验过程中的所需时间，通过用无菌长针注射器刺穿硅胶管，将外部分子的浓缩溶液注入介质储液瓶中。注意：培养基中分子的最终浓度应根据先前对细胞毒性的了解以及预测/估计的通过细胞膜的扩散速率（如果有的话）来选择。 在NMR实验结束时，用空管替换含有细胞的管，并用水冲洗流动单元。 生物反应器原位清洁。 通过以1 mL / min流动以下溶液来清洁流动单元：0.2M氢氧化钠（NaOH）;3M柠檬酸;0.2 M NaOH，每次至少30分钟，然后用无菌过滤的超纯水>2小时。 每次运行后清洁并高压灭菌储液瓶和管道组件。 5. 核磁共振实验 核磁共振实验的设置。注意：在制备细胞内NMR样品之前，请事先执行这些步骤，以避免细胞收集和数据采集之间的任何延迟。 在 NMR 光谱仪上创建新数据集，并为所需的 NMR 实验设置参数。 设置一维 1H NMR 实验的参数。 将 1H 载波频率在水信号上以 4.7 ppm 居中。 选择 zgesgp 脉冲程序，将光谱宽度设置为 20 ppm，以及一个 1，000μs 180° 平方脉冲以抑制水。将扫描间延迟设置为 1 秒。通过 32 次扫描获取光谱。 对于表达未标记CA II的细胞：选择p3919gp脉冲程序，将光谱宽度设置为30 ppm以覆盖光谱的亚胺子区域，并调整二项式水抑制的延迟，使最大激发集中在目标信号的化学位移（d7 = 20 μs，950 MHz时）。将扫描间延迟设置为 ≥1 秒。通过 512 次扫描采集。 对于表达 15N标记SOD1的细胞：选择sfhmqf3gpph脉冲程序，将 1H和 15N光谱宽度分别设置为16和50 ppm，形状脉冲偏移和激励带宽分别设置为8.5和6 ppm，以及用于去耦方案的350 μs脉冲（garp4或其他，具体取决于仪器）。将扫描间延迟设置为 0.3 秒。在 15N 维度上以 16 次扫描和 128 次增量进行采集。 实时核磁共振波谱采集。 将生物反应器插入NMR光谱仪后，等待几分钟以允许介质的交换。注：当PBS被含有2O的介质取代时，从锁定信号的外观可以很容易地监控此过程。 调整 1H通道的匹配和调谐，填充磁铁，并计算 1H 90°硬脉冲长度。 根据 1H硬脉冲调整每个脉冲序列中的 1H功率水平。 记录第一个zgesgp 1H光谱，以检查样品含量和现场均匀性。 将 zgesgp 和 p3919gp/sfhmqcf3gpph 实验复制到所需数量，并在采集后台处理程序中将它们排队。注：zgesgp光谱仅用于控制样品的状态和场均一性;因此，可以跳过它们或降低记录频率。 对于表达未标记CA II的细胞：通过应用零填充和指数线展宽窗口函数（LB = 20 Hz）来处理p3919gp光谱。 对于表达 15N标记的SOD1的细胞：通过在两个维度上应用零填充和平方正弦钟窗口函数（SSB = 2）来处理sfhmqcf3gpph光谱。注意：通过去除没有信号的区域，可以进一步减小处理光谱的大小（在Topspin中，这是通过设置所需的STSR和STSI值来完成的）。 6. 微细胞沉降系统分析 对于 CA II 光谱的分析，请在 MATLAB R2019b 中导入一维光谱区域。 在软件中，在 “处理数据集 列表”菜单中创建要导出的试验列表。 使用 au 程序 convbin2asc 的修改版本，以 ASCII 格式导出每个频谱的感兴趣光谱区域。注意：这将在每个频谱子目录中创建一个名为 ascii-spec.txt 的文本文件。 在 MATLAB 中，使用自定义脚本导入光谱区域Load_ascii_spectra。注意：此脚本需要数据集目录作为输入，并生成包含堆叠 1D 光谱的 2D 阵列光谱和包含化学位移的 1D 数组 cs。 运行Load_acqus脚本以从一维光谱中提取时间戳。注意：此脚本生成一个 1D 数组times_hours，其中包含每个频谱的时间增量（以小时为单位），初始频谱时间为 0。 要分析 SOD1 光谱，请在 MATLAB R2020b 中导入 2D 光谱。 在 Topspin 中，创建要在 “处理数据集列表 ”菜单中导出的试验列表。 在 MATLAB 中，使用自定义脚本导入 2D 光谱Load_2D_spectra。注意：此脚本需要数据集目录作为输入，并生成包含堆叠 2D 光谱的 3D 数组 Spectra 和包含化学位移的 1D 数组 cs。 运行Load_acqus脚本以从 2D 光谱中提取时间戳。 在自定义脚本Cut_2D_spectra中指定感兴趣的光谱区域，并运行脚本以剪切3D子阵列[（1H x 15N）光谱强度）x时间];将它们重塑为 2D 阵列（时间点 x 光谱强度）并将它们连接在一起。注：这将生成一个包含重塑和连接光谱区域的 2D 阵列JoinSpec_flat。 在 GUI 模式下运行 MCR-ALS 2.0。 通过运行mcr_main脚本打开 MCR-ALS 2.0 GUI。 在 “数据选择 ”选项卡中，加载光谱或JoinSpec_flat矩阵。可以绘制数据以进行检查。 通过奇异值分解 （SVD） 或手动评估组件的数量。注意：组分的数量应与实验中存在的不同物种的数量相对应。在这种情况下n = 2，对应于游离和结合的蛋白质。 选择一种初始估计纯光谱的方法。可以使用最纯粹的变量检测或演化因子分析（EFA）。 在 “数据集的选择” 窗口中，选择“ 继续”。 在“ 约束： 行模式 ”窗口中设置浓度的约束。应用非负性约束，选择fnnls（快速非负性约束最小二乘法）作为“实现和2种”。应用 1 个闭合约束，将约束设置为 1，将闭合条件设置为“等于”并应用于所有物种。注意：这强制每个物种浓度的总和等于1，以便每个物种获得的轮廓相对于总蛋白质浓度进行归一化。 在“ 约束： 列模式 ”窗口中设置光谱的约束。应用非负性约束，选择fnnls作为“实现和2种”。注：如果 NMR 光谱中存在负信号，则不应应用此约束。 在最后一个窗口中，设置 50 次迭代和 0.01 收敛标准。指定“浓度”、“光谱”和“标准偏差”的输出名称。单击 继续 运行 MCR-ALS 管接头。注：图形窗口将显示拟合结果，并附有浓度剖面图和纯组分光谱图。 对于 SOD1 数据集：使用自定义脚本Rebuild_2D_spectra从 MCR-ALS 的 1D 输出重建 2D 光谱区域并绘制它们。 7. 台盼蓝测试 用巴斯德移液管回收 NMR 管含量，并将琼脂糖线转移到 1.5 mL 封盖管中。 通过用600μLPBS冲洗琼脂糖线并将其在室温下以4，000× g 离心1分钟来除去残留培养基。丢弃上清液。 加入250μLPBS和50μL0.4%台盼蓝溶液。 用连续移液孵育2分钟。 用600μLPBS洗涤两次，丢弃上清液。 将几根琼脂糖线放在显微镜载玻片上，用剃须刀片切碎它们以形成小片凝胶。选择最薄的切片（厚度<0.4 mm，理想情况下约为0.2 mm）进行分析。 将凝胶切片转移到自制细胞计数室中，该计数室由两个载玻片组成，每侧间隔三层石蜡膜（总厚度约为0.4mm）。注意：也可以使用腔室滑轨;然而，比腔室高度（0.1 mm）更厚的凝胶切片将被挤压，使嵌入的细胞破裂。 获取琼脂糖内部细胞的图像并计数白色和蓝色细胞。 计算细胞活力为（总细胞 – 蓝细胞）/总细胞。