مراقبة تفاعلات البروتين والرباط في الخلايا البشرية عن طريق الرنين المغناطيسي النووي الكمي داخل الخلية في الوقت الفعلي باستخدام مفاعل حيوي عالي الكثافة للخلايا
Summary
يصف هذا البروتوكول إعداد مفاعل حيوي للرنين المغناطيسي النووي للحفاظ على الخلايا البشرية المغلفة قابلة للحياة لمدة تصل إلى 72 ساعة ، تليها الحصول على بيانات الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية وتحليلها بمرور الوقت. يتم تطبيق المنهجية لمراقبة التفاعلات بين البروتين والرباط داخل الخلايا في الوقت الفعلي.
Abstract
الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية هو نهج فريد لمراقبة الخصائص الهيكلية والديناميكية للجزيئات البيولوجية الكبيرة عند الدقة الذرية مباشرة في الخلايا الحية. يمكن ملاحظة طي البروتين والتعديلات الكيميائية والتغيرات التوافقية الناجمة عن ربط الليغاند. لذلك ، فإن هذه الطريقة لديها إمكانات كبيرة في سياق تطوير الأدوية. ومع ذلك ، فإن العمر القصير للخلايا البشرية المحصورة في مطياف الرنين المغناطيسي النووي يحد من نطاق تطبيق الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية. للتغلب على هذه المشكلة ، يتم استخدام المفاعلات الحيوية NMR التي يمكن أن تحسن بشكل كبير استقرار عينة الخلية بمرور الوقت ، والأهم من ذلك ، تمكين التسجيل في الوقت الفعلي لأطياف الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية. وبهذه الطريقة ، يمكن مراقبة تطور العمليات مثل اختراق الليغاند والارتباط بهدف البروتين داخل الخلايا في الوقت الفعلي. غالبا ما تكون المفاعلات الحيوية محدودة بسبب انخفاض صلاحية الخلايا عند أعداد الخلايا العالية ، مما يؤدي إلى مفاضلة بين الحساسية الكلية للتجربة وجدوى الخلية. لقد أبلغنا مؤخرا عن مفاعل حيوي للرنين المغناطيسي النووي يحافظ على عدد كبير من الخلايا البشرية النشطة استقلابيا لفترات طويلة من الزمن ، تصل إلى 72 ساعة. تم تطبيق هذا الإعداد لمراقبة تفاعلات البروتين والرباط والتعديل الكيميائي للبروتين. كما قدمنا سير عمل للتحليل الكمي لبيانات الرنين المغناطيسي النووي في الوقت الفعلي ، استنادا إلى دقة منحنى متعدد المتغيرات. توفر هذه الطريقة ملامح تركيز الأنواع الكيميائية الموجودة في الخلايا كدالة للوقت ، والتي يمكن تحليلها بشكل أكبر للحصول على المعلمات الحركية ذات الصلة. نقدم هنا وصفا مفصلا لإعداد المفاعل الحيوي NMR وتطبيقه لمراقبة تفاعلات البروتين والرباط في الخلايا البشرية.
Introduction
ظهر التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية (NMR) مؤخرا كنهج قوي للتحقيق في الخصائص الهيكلية والديناميكية للجزيئات الكبيرة داخل البيئة الخلوية1،2،3،4،5،6. نجح الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية في التحقيق في العمليات ذات الصلة وظيفيا مثل طي البروتين / سوء طيه 7,8,9 ، وربط المعادن7,10 ، وتكوين رابطة ثاني كبريتيد 11,12 ، وتفاعل البروتين مع البروتين13 ، وتفاعل البروتين – الليغاند 14,15,16 ، وتفاعل الحمض النووي – الليغاند 17 ، 18 في الخلايا البشرية الحية. أحد العوامل المحددة لتطبيقات الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية هو العمر القصير للخلايا أثناء التجربة. وينطوي حل هذه المشكلة على استخدام المفاعلات الحيوية للرنين المغناطيسي النووي. في هذه الأجهزة ، يتم تطبيق تدفق مستمر لوسط النمو على الخلايا ، والتي تبقى محصورة داخل مطياف الرنين المغناطيسي النووي ، من أجل توفير الأكسجين والمواد المغذية وإزالة المنتجات الثانوية السامة. بعد ظهور الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية، تم تطوير العديد من تصاميم المفاعلات الحيوية للرنين المغناطيسي النووي لتحسين صلاحية الخلية لفترات أطول من الزمن، حيث يتم تغليف البكتيريا أو خلايا الثدييات في هيدروجيل19،20،21،22 أو الاحتفاظ بها في تعليق وتنصهر من خلال استخدام غشاء غسيل الكلى المجهري23 . وقد سمحت هذه المفاعلات الحيوية بالحصول على تجارب أطول للرنين المغناطيسي النووي مع زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء (S/N)5، والأهم من ذلك، يمكن استخدامها للتحقيق في العمليات الخلوية في الوقت الحقيقي22،23،24. بفضل الحساسية الكيميائية والتوافقية العالية للرنين المغناطيسي النووي ، يمكن للتطبيق الأخير أن يوفر رؤى ثمينة حول حركية العمليات الوظيفية داخل الخلايا الحية بدقة ذرية.
في هذا البروتوكول ، نوضح كيفية إعداد وتشغيل مفاعل حيوي محسن تم الإبلاغ عنه مؤخرا25 ، والذي تم الحصول عليه من خلال الجمع بين تصميم مفاعل حيوي معياري موجود23 مع النهج الذي يعتمد على تغليف الخلايا في الهيدروجيل الذي كانت رائدة من قبل مجموعات أخرى19،20،21،22،26،27 . نحن نصف تطبيق المفاعل الحيوي على دراسات الرنين المغناطيسي النووي في الخلية في الوقت الحقيقي لربط ربط الليجند داخل الخلايا بالبروتين في خلايا HEK293T. في المفاعل الحيوي ، يتم تغليف الخلايا بكثافة عالية في خيوط هلام الأغاروز ويتم الحفاظ عليها قابلة للحياة للغاية ونشطة استقلابيا لمدة تصل إلى 72 ساعة ، يتم خلالها تسجيل تجارب الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية في الوقت الفعلي. يتكون المفاعل الحيوي من أنبوب زجاجي يناسب مجسات الرنين المغناطيسي النووي القياسية مقاس 5 مم مانعة للماء ومتصلة بحامل أنبوب بحيث يكون قطر غرفة العينة الداخلية 4.2 مم داخليا وارتفاعها 38 مم وحجمها 526 ميكرولتر. المدخل عبارة عن شعيرات شعرية PEEK بطول 7 أمتار (o.d. = 1/32 “، أي = 0.5 مم) يتم إدخالها في غرفة العينة وصولا إلى ~ 6 مم من الأسفل ، في حين أن المخرج عبارة عن شعيرات شعرية PTFE بطول 7 أمتار (o.d. = 1/32 “، i.d. = 0.5 مم) متصلة في الجزء العلوي من حامل الأنبوب (الشكل 1). يتم إدخال الأنابيب بشكل محوري في خط يتم التحكم في درجة حرارته متصل بحمام مائي. يتم توصيل المدخل والمخرج من خلال أنابيب PEEK بصمام 4 اتجاهات ، 2-position متصل بمضخة FPLC للتحكم في التدفق المتوسط وحاوية النفايات.
يتم تطبيق المفاعل الحيوي لدراسة حركية التفاعل ، الذي تم الإبلاغ عنه سابقا 14,25 ، بين عقارين ، acetazolamide (AAZ) و methazolamide (MZA) ، في الخلايا البشرية مع الشكل الثاني من الأنهيدراز الكربوني البشري (CA II) ، وهو هدف ذي صلة دوائية 28,29,30 ، وحركية تكوين رابطة ثاني كبريتيد داخل الجزيئية ، التي يعززها الجزيء الصغير ebselen25 ، 31 ، من شكل النحاس البشري الخالي من النحاس والزنك ، ديسموتاز الزنك الفائق الأكسيد (SOD1) ، وهو إنزيم مضاد للأكسدة متورط في بداية التصلب الجانبي الضموري 7،8،32. وأخيرا، يتم إجراء التحليل الكمي لبيانات الرنين المغناطيسي النووي في الوقت الحقيقي في MATLAB باستخدام خوارزمية المربعات الصغرى متعددة المتغيرات (MCR-ALS)33، والتي يتم من خلالها الحصول على المكونات الطيفية النقية وملامح التركيز كدالة للوقت للأنواع المرصودة، والتي يمكن تحليلها بشكل أكبر للحصول على المعلمات الحركية ذات الصلة.
يبدأ البروتوكول من قارورة T75 من خلايا HEK293T (~ 3 × 107 خلايا لكل قارورة) تبالغ بشكل عابر في التعبير إما عن CA II البشري (غير المصنف) أو SOD1 البشري (المسمى 15N). نمت الخلايا وحافظت عليها في قوارير T75 مع ارتفاع نسبة الجلوكوز DMEM بنسبة 1:10 كل 3-4 أيام وتم نقلها باستخدام cDNA الذي يشفر البروتين محل الاهتمام قبل 48 ساعة من التجربة. وترد تفاصيل الخطوات التي تنطوي عليها هذه المرحلة في أماكن أخرى(34).
Protocol
Representative Results
Discussion
الهدف من استخدام مفاعل حيوي لتجربة الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية هو الحفاظ على الخلايا حية ونشطة استقلابيا لفترة طويلة من الزمن. ويجب أن يؤخذ في الاعتبار عدد من الجوانب الحاسمة لتحقيق هذا الهدف. أولا ، من الأهمية بمكان تجنب التلوث البكتيري عند إعداد عينة الخلية وأثناء الحصول على بيانات الرنين المغناطيسي النووي. إذا تم استخدام سلالات من الإشريكية القولونية أو غيرها من البكتيريا التي يشيع استخدامها لاستنساخ الجينات والتعبير عن البروتين المؤتلف في المختبر، فإنها قد تلوث الخلايا أثناء إعداد العينة. بمجرد دخولها إلى المفاعل الحيوي ، ستنمو البكتيريا بسرعة مستغلة وسط النمو الطازج وستسبب موت الخلايا بسبب إنتاج السموم الداخلية. يتم رصد التلوث البكتيري فقط في مرحلة متقدمة ، عندما يتحول متوسط النمو إلى اللون الأصفر والعكر. علاوة على ذلك ، يمكن أن يتسبب التنظيف غير الكامل للمفاعل الحيوي في تلوث المضخة أو الأنابيب بالبكتيريا أو الخمائر أو القوالب الشائعة.
شرط نجاح التجربة هو تجنب تكوين فقاعة الغاز. ومن شأن فقاعات الغاز المحاصرة بين خيوط الأغاروز في الحجم النشط لملف الرنين المغناطيسي النووي أن تحدث عدم تجانس كبير في المجال المغناطيسي، مما يتسبب في قمع غير كامل لإشارة H2O وفقدان شديد للجودة الطيفية (الشكل 2 د). قد تكون الفقاعات ناتجة عن الهواء المحبوس في النظام أو عن طريق تكوين CO2 الغازي. يمكن تجنب الأول بسهولة عن طريق تنظيف النظام بوسط قبل إدخال عينة الخلية ، بينما لتجنب الأخير ، يوصى بتقليل تركيز NaHCO3 في وسط النمو ، والحفاظ على جميع أجزاء النظام عند درجة حرارة ثابتة لتقليل الاختلافات في قابلية ذوبان CO2. قد يتسبب التمثيل الغذائي الهوائي الخلوي أيضا في تكوين CO2 الغازي ، والذي يمكن منعه عن طريق زيادة معدل التدفق.
يجب التحقق من صلاحية الخلية بعد كل تشغيل بواسطة Trypan Blue Test. ومع ذلك ، هذا لا يوفر رؤى حول النشاط الأيضي. للحصول على صورة أكثر اكتمالا للحالة الأيضية للخلايا أثناء تشغيل المفاعل الحيوي ، يمكن إجراء أطياف الرنين المغناطيسي النووي 31P لتقييم إنتاج ATP كدالة للوقت23,25. ومع ذلك ، غالبا ما يكون المسبار المخصص ضروريا لهذا القياس ، مما قد يسمح بالتسجيل المتزامن باستخدام 1H NMR.
في حالة CA II ، فإن وجود إشارات مراسلة جيدة الحل في منطقة غير عادية من طيف 1H يسهل التحليل من أطياف الرنين المغناطيسي النووي 1D البسيطة ولا يتطلب إثراء النظائر أثناء التعبير عن البروتين. وبوجه عام، يمكن أن تؤدي البروتينات الأخرى إلى ظهور إشارات 1H مفيدة لرصد التغيرات الطيفية في مناطق أخرى، مثل تلك النموذجية لنواة البروتين الكارهة للماء بين 0 و-1 جزء في المليون11؛ ومع ذلك ، تميل هذه المناطق إلى أن تكون مزدحمة بالبروتينات المطوية التي يزيد حجمها عن ~ 10 كيلو دالتون. في هذه الحالة ، كما هو موضح في SOD1 ، من الأفضل إثراء البروتين ب 15N ، من خلال توفير وسط نمو غني ب 15N بشكل موحد أثناء التعبير عن البروتين ، ومراقبة التغيرات في الوقت الفعلي في أطياف الرنين المغناطيسي النووي 2D 1H-15N. يتم استيراد أطياف 2D كمصفوفات ثنائية الأبعاد في MATLAB ، ويعاد ترتيبها إلى صفائف 1D ومكدسة قبل تحليل MCR-ALS. ينطبق النهج الأخير بشكل عام على أي بروتين داخل الخلايا يؤدي إلى إشارات يمكن اكتشافها ، ويوفر معلومات عن التغيرات التوافقية للبروتين على مستوى البقايا المفردة. ومن حيث المبدأ، يمكن تعميم النهج الأخير على أطياف التنمية غير الزراعية وعلى مخططات وسم النظائر الأخرى.
فيما يتعلق بالتطبيق على أنواع مختلفة من الخلايا ، يجب تكييف البروتوكول بسهولة مع خطوط الخلايا المختلفة ولا يتطلب أن يتم التعبير عن البروتين محل الاهتمام مباشرة في الخلايا. لذلك ، يمكن دمج طرق أخرى للرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية مع هذا البروتوكول ، حيث يتم إنتاج الجزيء الكبير ذي الأهمية بشكل مؤتلف ، أو تصنيعه ، ثم إدخاله لاحقا في الخلايا عن طريق الكهربية أو بطرق التسليم الأخرى 1،9،38. عند العمل مع خطوط خلوية مختلفة أو بروتوكولات تحضير العينات ، قد تحتاج معلمات مثل تركيز الأغاروز وسمك الخيط وكثافة الخلية النهائية في خيوط الأغاروز إلى التحسين تجريبيا. علاوة على ذلك ، يقتصر تطبيق البروتوكول الموصوف هنا على الخلايا التي تتسامح مع تغليف الأغاروز. قد تتطلب أنواع الخلايا الأخرى تركيبات هيدروجيل مختلفة، في حين يوصى بإعداد مختلف عند تحليل الخلايا التي تنمو أصلا في التعليق، على سبيل المثال، الاستفادة من غشاء غسيل الكلى المجهري المحوري لضمان انتشار المغذيات مع إبقاء الخلايا المعلقة محصورة في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي23.
بالمقارنة مع تصاميم المفاعلات الحيوية NMR الأخرى19،20،21،22 ، يعتمد الجهاز الموصوف هنا على وحدة تدفق متاحة تجاريا ، تم تكييفها مع تعديلات طفيفة. لذلك ، يمكن تكرار الجهاز بسهولة في مختبرات مختلفة ذات قابلية عالية للتكرار. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بالتشغيل الموحد والامتثال الكامل للوائح سلامة المختبرات الصارمة ، إذا لزم الأمر. وعموما، ينبغي أن تسمح مرونة وسهولة تشغيل المفاعل الحيوي بالعديد من التطبيقات الأخرى للرنين المغناطيسي النووي للمحلول، سواء في الخلايا أو في المختبر، بالإضافة إلى تلك التي سبق الإبلاغ عنها23،25. وفي نهاية المطاف، يمكن تطبيق نفس تصميم المفاعل الحيوي على العينات التي تشبه إلى حد كبير البيئة الفسيولوجية للأنسجة، مثل الكرويات أو المواد العضوية، شريطة العثور على سقالات مناسبة للحفاظ على هذه العينات على قيد الحياة – أو حتى الحفاظ على نموها – في مطياف الرنين المغناطيسي النووي.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال iNEXT-Discovery ، رقم المنحة 871037 ، بتمويل من برنامج Horizon 2020 التابع للمفوضية الأوروبية ، ومن قبل Instruct-ULTRA ، والمنحة رقم 731005 ، وهو مشروع الاتحاد الأوروبي H2020 لمواصلة تطوير خدمات Instruct-ERIC ، ومن قبل Ministero dell’Istruzione ، dell’Università e della Ricerca PRIN grant 20177XJCHX. يعترف المؤلفون بدعم Instruct-ERIC ، وهو مشروع Landmark ESFRI ، من خلال جائزة JRA رقم 815 واستخدام موارد CERM / CIRMMP Italy Center. نشكر ماتيو بينيستري (بروكر، المملكة المتحدة) على تقديم الدعم لتشغيل وحدة تدفق InsightMR.
Materials
| Materials | |||
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| D2O | Sigma-Aldrich | 453366 | |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 10313-021 | |
| DMEM, high glucose, powder | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| FBS | Life Technologies | 10270 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030 | |
| Low-gelling agarose, powder | Sigma-Aldrich | A4018 | |
| NaHCO3, powder | Carlo Erba | 478537 | |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Penicillin–streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| NaOH, pellets | Sigma-Aldrich | 30620 | |
| Trypan Blue solution (0.4% (wt/vol) | Sigma-Aldrich | T8154 | Hazard statement(s): H350 may cause cancer. |
| Trypsin–EDTA (0.05% (wt/vol)) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| Avance III Spectrometer equipped with a 5 mm CryoProbe | Bruker | n/a | All modern spectrometers and narrow-bore magnets equipped with 5 mm probes are compatible. |
| InsightMR flow unit | Bruker | n/a | |
| P-920 pump module from ÄKTA FPLC | GE Healthcare | n/a | Any FPLC, HPLC peristaltic or syringe pump should be compatible with the flow unit. |
Referencias
- Inomata, K., et al. High-resolution multi-dimensional NMR spectroscopy of proteins in human cells. Nature. 458 (7234), 106-109 (2009).
- Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4, 108-118 (2017).
- Dzatko, S., et al. Evaluation of the stability of DNA i-motifs in the nuclei of living mammalian cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (8), 2165-2169 (2018).
- Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR in human cells: direct protein expression allows structural studies of protein folding and maturation. Accounts of Chemical Research. 51 (6), 1550-1557 (2018).
- Tanaka, T., et al. High-resolution protein 3D structure determination in living eukaryotic cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (22), 7284-7288 (2019).
- Siegal, G., Selenko, P. Cells, drugs and NMR. Journal of Magnetic Resonance. 306, 202-212 (1997).
- Banci, L., et al. Atomic-resolution monitoring of protein maturation in live human cells by NMR. Nature Chemical Biology. 9 (5), 297-299 (2013).
- Luchinat, E., et al. In-cell NMR reveals potential precursor of toxic species from SOD1 fALS mutants. Nature Communications. 5, 5502 (2014).
- Theillet, F. -. X., et al. Structural disorder of monomeric α-synuclein persists in mammalian cells. Nature. 530 (7588), 45-50 (2016).
- Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Intracellular metal binding and redox behavior of human DJ-1. Journal of biological inorganic chemistry: JBIC: A Publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 23 (1), 61-69 (2018).
- Banci, L., Barbieri, L., Luchinat, E., Secci, E. Visualization of redox-controlled protein fold in living cells. Chemistry & Biology. 20 (6), 747-752 (2013).
- Mercatelli, E., Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Direct structural evidence of protein redox regulation obtained by in-cell NMR. Biochimica Et Biophysica Acta. 1863 (2), 198-204 (2016).
- Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Protein interaction patterns in different cellular environments are revealed by in-cell NMR. Scientific Reports. 5, 14456 (2015).
- Luchinat, E., et al. Drug screening in human cells by NMR spectroscopy allows the early assessment of drug potency. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (16), 6535-6539 (2020).
- Luchinat, E., et al. Intracellular binding/unbinding kinetics of approved drugs to carbonic anhydrase II observed by in-cell NMR. ACS Chemical Biology. 15 (10), 2792-2800 (2020).
- DeMott, C. M., et al. Potent inhibitors of mycobacterium tuberculosis growth identified by using in-cell NMR-based screening. ACS Chemical Biology. 13 (3), 733-741 (2018).
- Krafcikova, M., et al. Monitoring DNA-ligand interactions in living human cells using NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (34), 13281-13285 (2019).
- Broft, P., et al. In-cell NMR of functional riboswitch aptamers in eukaryotic cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).
- Sharaf, N. G., Barnes, C. O., Charlton, L. M., Young, G. B., Pielak, G. J. A bioreactor for in-cell protein NMR. Journal of magnetic resonance. 202 (2), 140-146 (2010).
- Kubo, S., et al. A gel-encapsulated bioreactor system for NMR studies of protein-protein interactions in living mammalian cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 52 (4), 1208-1211 (2013).
- Inomata, K., Kamoshida, H., Ikari, M., Ito, Y., Kigawa, T. Impact of cellular health conditions on the protein folding state in mammalian cells. Chemical Communications. 53 (81), 11245-11248 (2017).
- Breindel, L., DeMott, C., Burz, D. S., Shekhtman, A. Real-time in-cell nuclear magnetic resonance: ribosome-targeted antibiotics modulate quinary protein interactions. Bioquímica. 57 (5), 540-546 (2018).
- Cerofolini, L., et al. Real-time insights into biological events: in-cell processes and protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 116 (2), 239-247 (2019).
- Breindel, L., Burz, D. S., Shekhtman, A. Active metabolism unmasks functional protein-protein interactions in real time in-cell NMR. Communications Biology. 3, (2020).
- Luchinat, E., Barbieri, L., Campbell, T. F., Banci, L. Real-time quantitative in-cell NMR: ligand binding and protein oxidation monitored in human cells using multivariate curve resolution. Analytical Chemistry. 92 (14), 9997-10006 (2020).
- Koczula, K. M., et al. Metabolic plasticity in CLL: adaptation to the hypoxic niche. Leukemia. 30 (1), 65-73 (2016).
- Alshamleh, I., et al. Real-time NMR spectroscopy for studying metabolism. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (6), 2304-2308 (2020).
- Supuran, C. T. Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors and activators. Nature Reviews. Drug Discovery. 7 (2), 168-181 (2008).
- Neri, D., Supuran, C. T. Interfering with pH regulation in tumours as a therapeutic strategy. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 767-777 (2011).
- Alterio, V., Di Fiore, A., D’Ambrosio, K., Supuran, C. T., De Simone, G. Multiple binding modes of inhibitors to carbonic anhydrases: how to design specific drugs targeting 15 different isoforms. Chemical Reviews. 112 (8), 4421-4468 (2012).
- Capper, M. J., et al. The cysteine-reactive small molecule ebselen facilitates effective SOD1 maturation. Nature Communications. 9 (1), 1693 (2018).
- Trist, B., Hilton, J. B., Crouch, P. J., Hare, D. J., Double, K. L. Superoxide dismutase 1 in health and disease: How a front-line antioxidant becomes neurotoxic. Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).
- Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
- Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Characterization of proteins by in-cell NMR spectroscopy in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 11 (6), 1101-1111 (2016).
- Piotto, M., Saudek, V., Sklenár, V. Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions. Journal of biomolecular NMR. 2 (6), 661-665 (1992).
- Vasa, S. K., Singh, H., Grohe, K., Linser, R. Assessment of a large enzyme-drug complex by proton-detected solid-state NMR spectroscopy without deuteration. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (17), 5758-5762 (2019).
- Schanda, P., Brutscher, B. Very fast two-dimensional NMR spectroscopy for real-time investigation of dynamic events in proteins on the time scale of seconds. Journal of the American Chemical Society. 127 (22), 8014-8015 (2005).
- Ogino, S., et al. Observation of NMR signals from proteins introduced into living mammalian cells by reversible membrane permeabilization using a pore-forming toxin, streptolysin O. Journal of the American Chemical Society. 131 (31), 10834-10835 (2009).
