Microkristal elektronendiffractie van kleine moleculen
Summary
Hier beschrijven we de procedures die in ons laboratorium zijn ontwikkeld voor het bereiden van poeders van kleine molecuulkristallen voor microkristalelektronendiffractie (MicroED) -experimenten.
Abstract
Een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van kleine molecuulmonsters voor microkristalelektronendiffractie (MicroED) experimenten wordt beschreven. MicroED is ontwikkeld om structuren van eiwitten en kleine moleculen op te lossen met behulp van standaard elektronen cryo-microscopie (cryo-EM) apparatuur. Op deze manier zijn kleine moleculen, peptiden, oplosbare eiwitten en membraaneiwitten onlangs bepaald tot hoge resoluties. Protocollen worden hier gepresenteerd voor het voorbereiden van rasters van geneesmiddelen met kleine moleculen met behulp van het medicijn carbamazepine als voorbeeld. Protocollen voor het screenen en verzamelen van gegevens worden gepresenteerd. Aanvullende stappen in het totale proces, zoals data-integratie, structuurbepaling en verfijning, worden elders gepresenteerd. De tijd die nodig is om de rasters met kleine moleculen voor te bereiden, wordt geschat op minder dan 30 minuten.
Introduction
Microcrystal electron diffraction (MicroED) is een elektron cryo-microscopie (cryo-EM) methode voor het bepalen van atomaire resolutie structuren van sub-micrometer grootte kristallen 1,2. Kristallen worden aangebracht op standaard transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) -roosters en bevroren door zich in vloeibaar ethaan of vloeibare stikstof te storten. Roosters worden vervolgens geladen in een TEM die werkt bij cryogene temperaturen. Kristallen bevinden zich op het rooster en worden gescreend op initiële diffractiekwaliteit. MicroED-gegevens met continue rotatie worden verzameld uit een subset van de gescreende kristallen, waarbij de gegevens met een snelle camera worden opgeslagen als een film3. Deze films worden omgezet naar een standaard kristallografisch formaat en bijna identiek verwerkt als een röntgenkristallografie-experiment4.
MicroED is oorspronkelijk ontwikkeld om eiwitmicrokristallen 1,2 te onderzoeken. Een knelpunt in eiwitkristallografie is het kweken van grote, goed geordende kristallen voor traditionele synchrotron röntgendiffractie-experimenten. Omdat elektronen interageren met materieordes van grootte die sterker zijn dan röntgenstralen, zijn de beperkingen van de kristalgrootte die nodig is om detecteerbare diffractie te produceren aanzienlijk kleiner5. Bovendien is de verhouding tussen elastische en inelastische verstrooiingsgebeurtenissen gunstiger voor elektronen, wat suggereert dat meer bruikbare gegevens kunnen worden verzameld met een kleinere totale blootstelling5. Constante ontwikkelingen hebben het mogelijk gemaakt om MicroED-gegevens te verzamelen van de meest uitdagende microkristallen 6,7,8,9.
Onlangs is aangetoond dat MicroED een krachtig hulpmiddel is voor het bepalen van de structuren van geneesmiddelen met kleine moleculen uit schijnbaar amorfe materialen10,11,12,13. Deze poeders kunnen rechtstreeks uit een fles gekocht reagens, een zuiveringskolom of zelfs uit het verpletteren van een pil tot een fijn poederkomen 10. Deze poeders lijken amorf met het oog, maar kunnen volledig zijn samengesteld uit nanokristallen of slechts sporenhoeveelheden nanokristallijne afzettingen bevatten in een grotere niet-kristallijne, amorfe fractie. Het aanbrengen van het materiaal op het raster is eenvoudig en de volgende stappen van kristalidentificatie, screening en gegevensverzameling kunnen in de nabije toekomst zelfs worden geautomatiseerd14. Terwijl anderen verschillende methoden kunnen gebruiken voor monstervoorbereiding en gegevensverzameling, zijn hier de protocollen die zijn ontwikkeld en gebruikt in het Gonen-laboratorium voor het voorbereiden van monsters van kleine moleculen voor MicroED en voor gegevensverzameling gedetailleerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Monstervoorbereiding is meestal een iteratief proces, waarbij optimalisaties worden gemaakt na sessies van screening en gegevensverzameling. Voor monsters met kleine moleculen is het vaak verstandig om eerst te proberen het raster te bereiden zonder de roosters te ontladen, omdat veel geneesmiddelen de neiging hebben hydrofoobte zijn 10,11. Als de roosters te weinig nanokristallijne afzettingen hebben, is het een goed idee om het opnieuw te proberen nadat de roos…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het Gonen-lab wordt ondersteund door fondsen van het Howard Hughes Medical Institute. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health P41GM136508.
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
Referencias
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345 (2013).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
- Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
- Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
- Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
- Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
- Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
- de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
- de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
- Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).
