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Neurociencias

Un test basé sur la spectroscopie de fluorescence à temps efficace pour évaluer l’état de polymérisation de l’actine dans les tissus cérébraux des rongeurs et des humains

Published: June 03, 2021
doi:
10.3791/62268
,
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences,University of Otago

Summary

Nous rapportons une analyse simple, rapide et à haut débit basée sur la spectroscopie de fluorescence pour la quantification des filaments d’actine dans des échantillons biologiques ex vivo des tissus cérébraux des rongeurs et des sujets humains.

Abstract

L’actine, le composant principal du cytosquelette, joue un rôle essentiel dans le maintien de la structure et de la fonction neuronales. Sous les états physiologiques, l’actine se présente en équilibre sous ses deux formes : globulaire monomère (G-actine) et filamenteuse polymérisée (F-actine). Aux bornes synaptiques, le cytosquelette d’actine forme la base des fonctions pré- et post-synaptiques critiques. De plus, les changements dynamiques dans le statut de polymérisation de l’actine (interconversion entre les formes globulaires et filamenteuses d’actine) sont étroitement liés aux altérations liées à la plasticité de la structure et de la fonction synaptiques. Nous rapportons ici une méthodologie basée sur la fluorescence modifiée pour évaluer le statut de polymérisation de l’actine dans des conditions ex vivo. Le test utilise de la phalloïde marquée par fluorescence, une phallotoxine qui se lie spécifiquement aux filaments d’actine (F-actine), fournissant une mesure directe de l’actine filamenteuse polymérisée. Comme preuve de principe, nous fournissons des preuves de la pertinence de l’essai à la fois dans les homogénats de tissu cérébral humain de rongeur et post mortem. En utilisant la latrunculinE A (un médicament qui dépolymérise les filaments d’actine), nous confirmons l’utilité du test dans la surveillance des altérations des niveaux de F-actine. De plus, nous étendons le dosage aux fractions biochimiques des terminaux synaptiques isolés dans lesquels nous confirmons une polymérisation accrue de l’actine lors de la stimulation par dépolarisation avec un K+extracellulaire élevé.

Introduction

L’actine protéique cytosquelettique est impliquée dans de multiples fonctions cellulaires, y compris le soutien structurel, le transport cellulaire, la motilité cellulaire et la division. L’actine se présente en équilibre sous deux formes : l’actine globulaire monomère (G-actine) et l’actine filamenteuse polymérisée (F-actine). Les changements rapides dans l’état de polymérisation de l’actine (interconversion entre ses formes G et F) entraînent un assemblage et un désassemblage rapides du filament et sous-tendent ses rôles régulateurs dans la physiologie cellulaire. L’actine forme le composant majeur de la structure cytosquelettique neuronale et influence un large éventail de fonctions neuronales1,2. Il convient de noter que le cytosquelette d’actine fait partie intégrante de la plate-forme structurelle des terminaux synaptiques. En tant que tel, il est un déterminant majeur de la morphogenèse et de la physiologie synaptiques et joue un rôle fondamental dans le contrôle de la taille, du nombre et de la morphologie des synapses3,4,5. En particulier, la polymérisation-dépolymérisation dynamique de l’actine est un déterminant clé du remodelage synaptique associé à la plasticité synaptique sous-jacente aux processus de mémoire et d’apprentissage. En effet, tant les fonctions présynaptiques (telles que la libération de neurotransmetteurs6,7,8,9,10)que postynaptiques (remodelage dynamique lié à la plasticité11,12,13,14)s’appuient de manière critique sur des changements dynamiques dans le statut de polymérisation du cytosquelette d’actine.

Dans des conditions physiologiques, les niveaux de F-actine sont régulés dynamiquement et étroitement par une voie multimodale impliquant une modification post-traductionnelle4,15,16 ainsi que des protéines de liaison à l’actine (ABPs)4,17. Les AOP peuvent influencer la dynamique de l’actine à plusieurs niveaux (tels que l’initiation ou l’inhibition de la polymérisation, l’induction de la ramification des filaments, la section des filaments en morceaux plus petits, la promotion de la dépolymérisation et la protection contre la dépolymérisation), et sont à leur tour sous un contrôle modulatoire rigoureux sensible à divers signaux extra- et intracellulaires18,19,20. De tels contrôles de réglementation à plusieurs niveaux dictent une réglementation stricte de la dynamique d’actine au cytosquelette synaptique, en affinant les aspects pré- et postsynaptic de la physiologie neuronale à la fois aux états basiques et induits par l’activité.

Compte tenu des rôles importants de l’actine dans la physiologie neuronale, il n’est pas surprenant que plusieurs études aient fourni des preuves d’altérations de la dynamique de l’actine en tant qu’événements pathogènes critiques liés à un large éventail de troubles neurologiques, y compris la neurodégénérescence, les maladies psychologiques ainsi que les affections neurodéveloppementales3,21,22, 23,24, 25,26,27. Malgré la richesse des données de recherche pointant vers des rôles clés de l’actine dans la physiologie neuronale et la physiopathologie, cependant, des lacunes importantes subsistent dans la compréhension de la dynamique de l’actine, en particulier au niveau du cytosquelette synaptique. D’autres études de recherche sont nécessaires pour avoir une meilleure compréhension de l’actine neuronale et de ses altérations dans des conditions pathologiques. L’un des principaux domaines d’intérêt dans ce contexte est l’évaluation de l’état de polymérisation de l’actine. Il existe des trousses commerciales occidentales à base de buvards (trousse biochimique d’essai in vivo de G-Actine/F-Actine; Cytosquelette SKU BK03728,29) et des tests faits maison pour l’évaluation des niveaux de F-actine6. Cependant, parce que ceux-ci exigent l’isolement biochimique de la F-actine et de la G-actine et parce que leur quantification suivante est basée sur des protocoles d’immunoblotting, ils peuvent prendre du temps. Nous rapportons ci-dessus un dosage spectroscopie-basé sur la fluorescence adapté d’une étude précédente30 avec des modifications qui peuvent être employées pour évaluer les deux niveaux basiques de F-actine, aussi bien que les changements dynamiques de son assemblage-démontage. Notamment, nous avons modifié efficacement le protocole original qui exige des échantillons adaptés à une cuvette de 1 mL au format actuel de plaque de 96 puits. Le protocole modifié a donc considérablement réduit la quantité de tissu/échantillon requise pour l’essai. De plus, nous fournissons des preuves que le protocole convient non seulement aux homogénats de tissu cérébral, mais également aux fractions subcellulaires telles que les terminaux synaptiques isolés (synaptosomes et synaptoneurosomes). Enfin, le test peut être utilisé pour les tissus cérébraux de rongeurs fraîchement disséqués et les échantillons de cerveau humain post mortem stockés à long terme. Il convient de noter que, bien que le test soit présenté dans un contexte neuronal, il peut être étendu de manière appropriée à d’autres types de cellules et processus physiologiques qui leur sont associés.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux règlements du Comité d’éthique de l’Université d’Otago sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (Protocole d’éthique No. AUP95/18 et AUP80/17) et le parlement néo-zélandais. Les tissus cérébraux humains ont été obtenus à partir de la banque de tissus neurologiques de la biobanque Clínic-IDIBAPS de l’hôpital de Barcelone, en Espagne. Tous les protocoles de prélèvement de tissus ont été approuvés par…

Representative Results

Linéarité du test pour l’évaluation des niveaux de F-actineTout d’abord, une courbe standard pour l’augmentation linéaire de la fluorescence de la phalloïde Alexa Fluor 647 a été établie et répétée pour chaque ensemble d’expériences(Figure 1). Pour étudier la plage linéaire de l’essai, différentes quantités d’homogénats cérébraux provenant de rongeurs(figures 2A et 2B)et de sujets humains post mortem<strong…

Discussion

Le dosage décrit ici, essentiellement adapté d’une étude précédente30 avec des modifications, utilise une phallotoxine, la phalloïde marquée d’une étiquette fluorescente. Les analogues de la phalloïde fluorescente sont considérés comme l’étalon-or pour la coloration des filaments d’actine dans les tissus fixes47,48,49. En fait, ce sont les outils les plus anciens pour identifier spéci…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Neurological Foundation of New Zealand (1835-PG), le New Zealand Health Research Council (#16-597) et le Département d’anatomie de l’Université d’Otago, en Nouvelle-Zélande. Nous sommes redevables à la Banque de tissus neurologiques de HCB-IDIBAPS BioBank (Espagne) pour les tissus cérébraux humains. Nous remercions Jiaxian Zhang pour son aide dans l’enregistrement et le montage de la vidéo.

Materials

3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube Beckman Coulter 349622 For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin Santa Cruz Biotechnology Sc-47778 For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH Abcam Ab181602 For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006 Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001 For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene Corning 3596 For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879 Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) Li-Cor Biosciences For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II Sigma-Aldrich G6257 Fixative
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A Sigma-Aldrich L5163 Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670 Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm Millipore LSWP01300 Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate Thermo Fisher Scientific 237105 For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm Millipore NY1H02500 Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV Abcam ab201115 For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich 71320 Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL944 Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL900 Krebs buffer component
SpectraMax i3x Molecular Devices For fluorometric measurements
Sucrose Fisher Chemical S/8600/60 Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder Millipore Sx0001300 Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem Duran Wheaton Kimble 358034 For tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Component of Permeabilization buffer
Trizma base Sigma-Aldrich T6066 Buffer ingredient for sample preparation
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Referencias

  1. Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
  2. Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
  3. Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
  4. Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
  5. Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
  6. Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
  7. Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
  8. Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
  9. Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
  10. Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  11. Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
  12. Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
  13. Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381 (2014).
  14. Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
  15. Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
  16. Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
  17. Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
  18. Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
  19. Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
  20. Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
  21. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  22. Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer’s disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
  23. Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer’s disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908 (2020).
  24. Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
  25. Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
  26. Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
  27. Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
  28. Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer’s disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
  29. Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer’s Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
  30. Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
  31. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), 99-108 (1999).
  32. Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992 (2016).
  33. Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647 (2018).
  34. Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
  35. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  36. Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
  37. Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neurociencias. 284, 311-324 (2015).
  38. Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
  39. Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
  40. Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
  41. Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer’s disease research. Brain Research. 1746, 147009 (2020).
  42. Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer’s disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119 (2018).
  43. Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer’s Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
  44. Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492 (2020).
  45. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118 (2018).
  46. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
  47. Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
  48. Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
  49. Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
  50. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
  51. Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
  52. Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
  53. Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA – Protein Structure. , (1975).
  54. Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
  55. Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
  56. Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
  57. Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
  58. Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
  59. Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, 14869-14871 (2009).

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Ahmad, F., Liu, P. A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues. J. Vis. Exp. (172), e62268, doi:10.3791/62268 (2021).
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