혈액-뇌 장벽 투과성을 높이기 위해 집중된 초음파 및 마이크로 버블 치료를 시각화하는 실시간 인트라바이탈 다광원 현미경 검사법

노르웨이 식품 안전 당국, 서니브룩 연구소 동물 관리 위원회 및 캐나다 동물 관리 위원회에 따라 다음과 같은 모든 실험 절차가 승인되고 수행되었습니다. 1. 재료 준비 두개골 창 수술 및 초음파 마이크로 버블 치료에 필요한 재료를 준비하십시오. 만성 두개골 창의 경우 살균 도구 및 재료, 멸균 수술 공간 및 수술 전 및 수술 후 약물 투여가 필요합니다23,24,25. 트랜스듀서 및 커버슬립 준비 트랜스듀서의 물리적 무결성을 확인합니다: 균열과 찌그러짐을 찾습니다. 트랜스듀서의 상단과 측면의 전극이 그대로 유지되었는지 확인합니다. 시아노아크라일트 접착제를 작은 접시에 넣습니다. 어플리케이터를 사용하여 얇은 접착제 층을 트랜스듀서 표면에 퍼감음으로 보입니다. 트랜스듀서를 유리 커버슬립에 놓습니다. 20-30 s를 단단히 누릅니다.참고: 3D 프팅 금형을 사용하여 유리 커버슬립을 링 트랜스듀서와 정렬하여 커버슬립 및 링 트랜스듀서에 단단하고 균일한 압력을 보장할 수 있습니다(그림 2). 트랜스듀서와 커버슬립 사이의 거품을 확인합니다. 거품이있는 경우, 공기가 초음파 전파를 방해로, 커버 슬립을 벗고 단계 1.2.3.에서 반복. 실온에서 하룻밤 동안 치료하십시오. 유리 커버슬립을 부착하면 트랜스듀서와 일치합니다(그림 3).참고: 이 프로토콜은 사내 제조 된 리드 지르코네이트 티타네이트 링 트랜스듀서 (10mm 외부 직경, 1.4mm 두께, 1.2mm 높이)35를 사용하여 50 Ω 임피던스 및 0 ° 위상 부하와 사용자 정의 일치 회로를 사용합니다. 트랜스듀서는 두께 모드에서 0.82MHz로 구동되어 커버슬립 아래에 약 1mm 의 원형 초점 지점을 생성합니다. 유사한 특성의 링 트랜스듀서(외경 10mm, 두께 1.5mm, 높이 1.1mm)를 특징으로 하며 다광광 현미경 실험27,28,29,31,32,36에 광범위하게 사용된다. 트랜스듀서 재사용 및 커버슬립 교체 금이 가거나 이전 실험에서 파편(예: 모피, 접착제)이 있는 경우 커버슬립을 교체하십시오. 커버슬립을 제거하려면 아세톤에 트랜스듀서와 커버슬립을 20분 동안 잠수하여 접착제를 녹입니다.참고: 아세톤은 트랜스듀서 및/또는 전극의 무결성에 영향을 줄 수 있습니다. 이 단계를 진행하기 전에 제조업체에 문의하십시오. 아세톤이 집게로 커버슬립을 부드럽게 당겨 접착제를 녹인지 확인합니다. 아세톤 노출이 길어지않도록 10분마다 한 번 확인하십시오. 2. 동물 준비 유도 챔버에서 의료 공기, 산소 및 이소플루란을 혼합하여 동물을 마취시합니다.참고: 운반체 가스로서의 산소 사용은 마이크로버블의 반감기에 영향을 미치는 것으로 보고되어 37,38로 BBB 투과성에서 유도된 초음파-마이크로버블 유도 증가의 크기를 감소시키지만 저산소증 및 사망률의 위험을 감소시킬 수도 있다39. 프로젝트 목표와 수의사의 조언에 따라 캐리어 가스를 선택합니다. 케타민/자일라진 칵테일과 같은 주사용 마취제도 사용될 수 있습니다. 그러나 흡입 성 마취및 혈액 산소 수준의 비행기를 조절하는 것이 더 쉽습니다. 동물이 발가락 핀치를 수행하여 마취의 충분한 평면을 달성했는지 확인하십시오. 동물의 무게를 측정하기 위해 dextran의 복용량을 결정, 마이크로 거품, 및 관리 하는 약물. 동물의 머리에서 털을 제거하고 동물을 스테레오전술 프레임에 놓습니다. 급성 실험의 경우, 디엑스트라안 및 마이크로버블 주사를 위해 전신 순환에 대한 접근이 확립되어야 합니다. 이를 위해 27g 카테터를 꼬리 정맥에 삽입합니다.참고: 복고풍 궤도 주사도 가능하지만, 다광 화상 진찰 중 헤드 영역의 제한된 작업 공간으로 인해 꼬리 정맥이 권장됩니다. 동물을 스테레오테틱 프레임으로 옮기고 마취를 코 콘으로 전환합니다. 가열 패드 또는 따뜻한 물로 채워진 장갑과 같은 열원을 사용하여 37 °C의 동물의 핵심 온도를 유지합니다. 맥박 산소계를 이용하여 직장 프로브 및 동물 생리학을 사용하여 동물 온도를 모니터링합니다. 안과 연고를 바치다. 적절한 수술 전 진통제 및/또는 항염증제를 주입 하십시오(재료 표 참조). 두개골 창 수술을 시작하기 전에 마취 의 비행기와 동물의 심박수, O2 포화, 호흡 속도 및 온도를 확인하십시오. 두개골 창 수술을 시작하려면 탈모 크림을 바르거나 모피 클리퍼를 사용하여 머리에 털을 제거하십시오. 눈 사이의 털을 목의 앞쪽 절반으로 제거합니다(그림 4A).참고 : 탈모 크림과의 장기간 접촉은 피부를 구울 것입니다. 만성 두개골 창 수술의 경우, 베타딘의 번갈아 닦아 두피를 씻고 모피 제거 후 70 % EtOH. 멸균 수술을 위한 수술 공간을 준비하십시오. 불임은 2.15단계까지 유지되어야 합니다. 두피를 제거하려면, 비 지배적 인 손에 개최 집게를 사용하여 눈 사이에 피부를 들어 올려, 처진 봉합사를 따라. 곡선 가위를 사용하여 피부를 제거하여 정수리 뼈를 노출시니다(그림 4B). 두개골이나 두피에서 출혈이 있는 경우 면 봉봉으로 단단한 압력을 가하십시오. 출혈은 다음 단계로 진행하기 전에 중지해야합니다.참고: 급성 수술의 경우, 피부를 밀어 내고 액체 시아노아크라일레이트 접착제 또는 조직 접착제를 사용하여 두개골에 부착할 수 있습니다. 면봉을 사용하여 두개골의 바깥쪽 표면을 덮는 음골을 제거합니다. 작동 현미경(6-25x)과 치과 드릴(0.5mm 드릴 버, 중간 속도)을 사용하여 정수리 뼈에 원을 윤곽을 잡아 두개골에 있는 두개골 창의 원하는 위치를 표시합니다(그림 5). 이 지역은 얇고 큰 혈관을 오버레이하기 때문에 처진 봉합사, 람다 및 bregma를 피하십시오.참고: 드릴링을 용이하게 하기 위해 마커와 스텐실(그림 5A)을 사용하여 두개골에 두개골 창의 윤곽선을 그릴 수 있습니다. 쥐의 경우 원형, 두개골 창 대신 직사각형을 드릴링하는 것이 더 쉬울 수 있습니다. 쥐 두개골 뼈의 두께로 인해 0.7mm 드릴 비트를 사용하여 0.5mm 드릴 비트를 사용하여 드릴링을 완료하기 전에 컴팩트 한 뼈의 두개골 창을 윤곽을 잡을 수 있습니다. 드릴 비트로 부드러운 압력을 가하십시오. 과도한 압력은 뇌 조직에 손상을 일으킬 위험을 증가시킵니다. 드릴링 중에 두개골이 과열되는 것을 방지하기 위해 주사기를 사용하여 두개골에 식염수를 떨어 뜨리거나 식염수에 담근 외과 스폰지 조각을 적용하십시오. 두개골의 나머지 부분과 뼈 섬이 분리 될 때까지 두개골을 드릴링하고 냉각하는 것을 번갈아 가십시오. 집게 나 드릴 비트를 사용하여 뼈 섬에 부드러운 압력을 가하여 드릴링 진행 상황을 확인하십시오. 뼈 섬이 두개골의 나머지 부분과 분리 될 때까지 드릴링을 계속합니다.참고 : 두개골의 가장 얇은 영역에 작은 균열은 드릴링이 거의 완료된 좋은 표시입니다. 뼈 섬을 조기에 제거하려고하면 뼈 조각이 뇌 조직으로 침투하여 두라를 손상시키고 염증과 출혈을 일으킬 수 있습니다. 뼈 섬의 가장자리 또는 상부 소형 뼈 층을 파악하기 위해 미세 한 집게 쌍을 사용하여 뼈 섬을 제거합니다 (그림 6A). 식염수에 미리 담근 외과 스폰지 조각을 적용하여 뇌가 촉촉하게 유지되도록하십시오. 출혈이 관찰되면 출혈부위에 수술용 스폰지를 놓습니다. 출혈이 멈출 때까지 다음 단계로 진행하지 마십시오.참고: 출혈이 5분 후에 지속되는 경우, 동물은 다광 화상 진찰 실험에 사용할 수 없습니다. 쥐의 경우, 두껍으면 두라를 제거해야 할 수도 있습니다. 두라를 제거하려면 작동 현미경과 미세 집게 쌍에 높은 배율을 사용하십시오. 두개골 창을 놓기 위해, 집게 한 켤레와 유리 커버 슬립을 데리러, 한쪽에 식염수 한 방울을 배치하고, 두개골의 구멍을 통해 기동. 커버슬립 아래에 기포가 없는지 확인합니다.참고: 쥐의 경우 5mm 유리 커버슬립과 쥐의 경우 8mm를 사용하십시오. 쥐의 경우, 두개골 뼈의 두께로 인해, 커버 슬립과 뇌 사이의 공간을 채우기 위해 식염수 대신 아가로즈 용액을 사용합니다. 트랜스듀서와 커버슬립은 두개골 창에 별도의 커버슬립을 사용하는 대신 두개골에 직접 부착할 수도 있습니다. 이 옵션을 보려면 3.1 단계로 진행합니다. 자세한 내용은 그림 1 을 참조하십시오. 두개골에 부착하기 위해 커버슬립(그림 6B)의 둘레에 시아노아크라일트 접착제층을 펴보시다. 커버슬립 아래에 접착제가 없는지 확인합니다. 접착제가 뇌와 접촉하지 않도록 커버 슬립에 압력을 가하십시오. 접착제가 완전히 건조되면 치과 드릴을 사용하여 접착제표면을 꺼낼 수 있습니다. 모든 접착제 파편이 수술 부위에서 제거되었는지 확인합니다.참고: 만성 두개골 창의 경우 필요한 수술 후 약물(재료 표 참조)을 주입하고 상처 관리 및 부드러운 식품에 대한 연고를 제공하고 열램프 아래에서 동물을 복구하십시오. 3. 링 트랜스듀서 배치 1% (w/v) 아가로즈 솔루션을 준비합니다. 작은 비커 또는 에렌마이어 플라스크에서 아가로즈 0.1 g와 PBS(1x) 또는 식염수10mL을 추가합니다. 비커를 핫플레이트에 놓거나 전자레인지(30-45s)에 용액을 가열하여 아가로즈가 완전히 용해될 때까지 용액을 끓입니다. 단계 3.2-3.5는 아가로즈 솔루션이 빠르게 냉각됨에 따라 시간에 민감합니다. 1 mL 주사기로 아가로즈의 0.5 mL을 인출하십시오.참고: 뇌의 무결성을 보호하기 위해 아가로즈의 온도가 사용하기 전에 체온에 근접하도록 하십시오. 아가로즈를 두개골 창의 덮개 슬립에 자유롭게 보관하십시오.참고 : 조직이 희미해지면 아가로즈의 온도가 너무 높았습니다. 동물은 안락사되어야 합니다. 뇌를 덮는 별도의 커버슬립이 없는 경우(즉, 트랜스듀서와 그 커버슬립은 뇌에 직접 배치되고, 단계 2.14참조), 아가로즈는 이 단계에서 뇌의 표면에 증착되어야 합니다. 트랜스듀서를 두개골 창 위에 놓습니다(그림 6C). 트랜스듀서와 두개골 창 사이에 최소한의 아가로즈가 있도록 단단한 압력을 가하십시오. 트랜스듀서가 두개골 창에 중심(XY-평면) 및 병렬(Z-평면)이고 아가로즈에 기포가 없는지 확인합니다. 아가로즈가 젤로와 같은 일관성으로 냉각되면 주걱이나 메스를 사용하여 트랜스듀서의 표지 슬립 둘레에서 과도한 아가로즈를 잘라냅니다. 트랜스듀서의 커버슬립 아래에 기포가 없는지 확인합니다. 주걱을 사용하여 트랜스듀서의 표지 슬립 둘레에 시아노아크라일트 접착제층을 확산하여 두개골로 확장하여 트랜스듀서가 두개골에 단단히 부착됩니다. 접착제가 완전히 건조 될 때까지 트랜스 듀서에 대한 단단한 압력을 유지 (10-15 분). 4. 다광현미경 영상 동물을 객관적인 렌즈 아래에 배치합니다(그림 7A). 객관적인 렌즈가 링 트랜스듀서에 중심이 되고 트랜스듀서와 평행하게 되어 있는지 확인합니다(그림 7B). 물에 침지하는 객관적인 렌즈를 사용하는 경우 링 트랜스듀서의 중앙을 탈온화 및 탈가스로 채웁니다.참고 : 탈기 물은 적절한 초음파 전파에 중요합니다. 목표 렌즈로 가장 높은 위치에서 시작한 다음 링 트랜스듀서 내에 들어질 때까지 목표 렌즈를 천천히 낮춥니다(그림 7A, B). 객관적인 렌즈가 트랜스듀서 또는 커버슬립과 충돌하지 않도록 합니다.참고: 접안 렌즈를 번갈아 사용하여 목표 렌즈의 Z 위치가 뇌 표면과 평면에 있는지 확인하고, 눈으로는 객관적인 렌즈가 트랜스듀서 또는 커버슬립과 충돌하지 않도록 합니다. 꼬리 정맥을 통해 형광 드엑스트라넨을 주입 한 다음 접피스를 통해 피알 혈관을 시각화하는 것이 더 쉬울 수 있습니다 (도 7C). 이미징을 위해 다광현미경을 준비합니다.참고: 이 프로토콜은 직립 다광자 현미경과 20-25x 의 작업 거리를 가지는 20-25x 목표 렌즈를 사용하여 커버슬립(들)을 넘어 뇌 의 parenchyma에 집중하기에 충분합니다. 덱센을 준비한다. 제조업체의 지침에 따라 적절한 양의 PBS를 dextran 바이알에 추가합니다. 1-3분 동안 도스엑스트라낸 용액을 소용돌이어 도포 파우더가 완전히 용해되도록 합니다. 꼬리 정맥에 덱스네 용액을 주입합니다. 이미지 스캔 설정 아이피스를 사용하여 객관적인 렌즈가 뇌와 평행하게 되어 있는지 확인합니다. XZ 및 YZ 정렬 불량에 대 한 수정 하는 동물을 기울인다. 다광현미경에서 시야를 선택합니다. 초음파 노출 전에 혈관의 기준선 이미지를 갖기 전에 XYZ 스캔을 설정합니다.참고: 일반적인 이미징 매개 변수는 다음과 같습니다: 깊이 300-800 μm, 2-5 μm 스텝 사이즈 및 10-20 시간 스택. 객관적인 렌즈가 이미징 시퀀스 중 가장 낮은 지점에서 트랜스듀서 또는 커버슬립과 접촉하지 않도록 합니다. 5. 초음파 노출 모든 BNC 케이블이 올바르게 연결되어 있는지 확인합니다(그림 3). 초음파 마이크로 버블 치료 전, 도중 및 후에 이미지 스택을 캡처할 수 있을 만큼 충분히 긴 XYZT 이미지 스캔을 설정합니다. 제조업체의 지시에 따라 마이크로 버블을 준비합니다. 꼬리 정맥에 마이크로 버블을 주입하고 이미징을 시작합니다.참고: 마이크로버블 주사는 일관된 주입 속도를 보장하고 동시 마이크로 버블 주입 및 이미징을 가능하게 하기 위해 주입 펌프로 수행될 수 있습니다. 이미징 중에 마이크로 버블을 주입해야 하는 경우 검출기를 주변 광에 노출하지 않고도 꼬리 정맥에 쉽게 접근할 수 있는지 확인합니다. 초음파 처리를 시작합니다.참고: 일반적인 초음파 처리 매개 변수는 다음과 같습니다 : 10 ms 주기, 0.2-0.4의 기계 지수, 1-4 Hz 사이의 펄스 반복 주파수. 초음파 및 전임상 초음파 마이크로 버블 연구에 사용되는 마이크로 버블 파라미터는 광범위하게 연구되었으며 문헌에 잘 문서화되어 있습니다 (예 : 검토에 대한 40 참조). 초음파 처리 기간 동안 및 초음파 처리의 끝 에 따라 다광 이미징을 계속합니다. 혈관에서 dextran 사치에 대 한 관찰, 이것은 BBB 투과성에 있는 증가 의 표시.참고: 외삽 공간에서 dextran이 감지되지만 시야 주변에서 볼 수 있는 경우 시야 외부의 혈관에 영향을 받을 수 있습니다. 이는 객관적인 렌즈의 초점과 트랜스듀서의 정렬 불량으로 인해 발생할 수 있습니다. 이 시나리오에서는, 변환기를 재정렬하는 것보다 객관적인 렌즈를 이동하거나 동물을 재배치하여 시야를 조정하는 것이 더 쉽습니다. 이미징이 완료되면 깊은 마취 또는 CO2 질식 하에서 동물 자궁 경부 탈구를 안락사시하십시오. 만성 두개골 창의 경우, 노출 된 두개골에 치과 시멘트층을 확산.참고 : 만성 두개골 창의 경우 2.8 단계에서 두피를 제거하기 때문에 필요한 것은 아니지만 창을 둘러싼 피부를 봉합 할 수 있습니다. 6. 이미지 분석 이미지 스택을 내보냅니다. 이미지 분석 소프트웨어(예: 올림푸스 플루오뷰, ImageJ/FIJI, 비트플레인 아이마리스, 써피피셔 과학 아미라) 및/또는 프로그래밍 도구(예: 파이썬, MATLAB)로 이미지를 분석합니다.