リアルタイムの生体内多光子顕微鏡で、血液脳関門透過性を高める、集中超音波治療とマイクロバブル治療を可視化

以下の実験手順はすべて、ノルウェー食品安全局、サニーブルック研究所の動物ケア委員会、カナダ動物ケア評議会によって承認され、実施されました。 1. 材料準備 頭蓋窓の外科および超音波マイクロバブルの処置のために必要な材料を準備する。慢性頭蓋窓、殺菌されたツールおよび材料、無菌の外科スペース、および手術前および手術後の薬物投与のために23,24,25が必要である。 トランスデューサおよびカバースリップの準備 トランスデューサの物理的な整合性を確認する:亀裂やへこみを探します。トランスデューサの上部と側面の電極がそのままであることを確認します。 シアノアクリル酸接着剤を小皿に入れます。接着剤の薄い層をトランスデューサの表面に広げるためにアプリケーターを使用します。 ガラスカバースリップにトランスデューサを置きます。20~30sの場合はしっかりと押し下げます。注:3Dプリント金型を使用すると、ガラスカバースリップをリングトランスデューサと整列させ、カバースリップとリングトランスデューサにしっかりと圧力を加えることができます(図2)。 トランスデューサとカバースリップの間の気泡を確認します。気泡がある場合は、カバースリップを取り外し、空気が超音波の伝播を妨げるように、ステップ1.2.3から繰り返します。室温で一晩硬化させます。 ガラスカバースリップに付着したら、トランスデューサと一致します(図3)。注:このプロトコルは、カスタムマッチング回路を備えた50 Ωインピーダンスと0°位相負荷に合わせて、社内で製造された鉛ジルコネートチタン化リングトランスデューサ(10mm外径、厚さ1.4mm、高さ1.2mm)35を使用します。トランスデューサは厚みモードで0.82 MHzで駆動され、カバースリップの下に約1mmの円形焦点点を生成します。類似の特性(10mm外径、厚さ1.5mm、高さ1.1mm)のリングトランスデューサは26を特徴としており、多光子顕微鏡実験27,28,29,31,32,36に広く使用されています。 トランスデューサの再利用とカバースリップの交換 カバースリップが割れたり、以前の実験の破片(毛皮、接着剤など)が残っている場合は交換してください。カバースリップを取り除くために、トランスデューサとカバースリップを20分間アセトンに浸して接着剤を溶かします。注:アセトンは、トランスデューサおよび/または電極の完全性に影響を与える可能性があります。この手順を進める前に、製造元に確認してください。 カバースリップを鉗子でそっと引っ張って、アセトンが接着剤を溶かしたかどうかを確認します。アセトンの長時間の暴露を避けるために10分ごとに1回チェックしてください。 2. 動物の準備 誘導室で医療用空気、酸素、イオフルランを混合して動物を麻酔します。注:キャリアガスとしての酸素の使用は、マイクロバブルの半減期に影響を与えると報告されています37,38そしてBBB透過性27の増加を引き起こした超音波マイクロバブルの大きさを減少させるが、低酸素症および死亡率39のリスクを減少させる可能性があります。プロジェクトの目的と獣医のアドバイスに基づいてキャリアガスを選択してください。ケタミン/キシラジンカクテルなどの注射用麻酔薬も使用できます。しかし、吸入可能な麻酔薬を使用する場合、麻酔と血中酸素濃度の面を制御することが容易です。 足指ピンチを行うことで、動物が十分な麻酔面を達成したことを確認します。動物の体重を量って、デキストラン、マイクロバブル、および投与する薬物の投与量を決定する。動物の頭から毛皮を取り除き、動物を定位フレームに置きます。 急性実験では、デキストランおよびマイクロバブル注射のために全身循環へのアクセスを確立する必要があります。これを達成するために、尾静脈に27gカテーテルを挿入します。メモ:レトロ軌道注入も可能ですが、マルチフォトンイメージング中のヘッドエリアの作業スペースが限られているため、尾静脈が推奨されます。 動物を定位フレームに移し、麻酔を鼻コーンに切り替えます。加熱パッドや温水で満たされた手袋などの熱源を使用して、動物のコア温度を37 °Cに保ちます。 直腸プローブを用いて動物の温度を監視し、パルスオキシメータを用いて動物生理学を行います。眼科軟膏を適用します。適切な手術前の鎮痛薬および/または抗炎症薬を注入する( 資料表を参照)。 頭蓋窓の手術を開始する前に、麻酔の平面と動物の心拍数、O2 飽和度、呼吸数、温度を確認してください。 頭蓋窓の手術を開始するには、脱毛クリームを塗布したり、毛皮のバリカンを使用して頭の毛を取り除きます。目の間から首の前半分まで毛皮を取り除きます(図4A)。注:脱毛クリームとの長時間の接触は、皮膚を燃やします。慢性頭蓋窓の手術の場合は、ベタジンの交互ワイプで頭皮を洗浄し、毛皮の除去後70%EtOHを洗浄します。無菌手術のための手術スペースを準備します。無菌はステップ2.15まで維持されなければならない。 頭皮を取り除くために、矢状縫合糸に沿って、非支配的な手で保持された鉗子を使用して目の間の皮膚を持ち上げます。湾曲したはさみを使用して、皮膚を取り除き、頭頂骨を露出させた(図4B)。頭蓋骨や頭皮からの出血がある場合は綿棒でしっかりと圧力をかける。次のステップに進む前に出血を止めなければならない。注:急性手術の場合、皮膚を押し戻し、液体シアノアクリレート接着剤または組織接着剤を使用して頭蓋骨に付着させることができます。 綿棒を使用して頭蓋骨の外表面を覆う骨膜を取り除きます。 手術顕微鏡(6-25x)と歯科ドリル(0.5 mmドリルバリ、中速)を使用して、頭頂骨に円を輪郭を描き、頭蓋骨の頭蓋窓の所望の位置を示します(図5)。これらの領域が薄く、大きな血管を重ねているため、矢状縫合糸、λ、およびブレグマは避けてください。注: 穴あけができるように、マーカーとステンシルを使用して頭蓋骨に頭蓋ウィンドウの輪郭を描くことができます(図 5A)。ラットの場合、円形の頭蓋窓の代わりに長方形を掘削する方が簡単かもしれません。ラットの頭蓋骨の厚さのために、0.5 mmドリルビットを使用して掘削プロセスを完了する前に、0.7 mmドリルビットを使用してコンパクトボーンの頭蓋窓の輪郭を描きます。 ドリルビットで穏やかな圧力を適用します。過剰な圧力は、脳組織に損傷を引き起こすリスクを高めます.掘削中に頭蓋骨が過熱するのを防ぐために、注射器を使用して頭蓋骨に生理食い物を滴下するか、生理食音に浸した外科スポンジを塗布します。 得られた骨の島が頭蓋骨の残りの部分から分離するまで、頭蓋骨を掘削して冷却するのとを交互に行います。鉗子またはドリルビットを使用して骨の島に穏やかな圧力を加えることによって、掘削の進捗状況を確認してください。骨の島が頭蓋骨の残りの部分から分離するまで掘削を続けます。注:頭蓋骨の最も薄い領域の小さな亀裂は、掘削がほぼ完了していることを示す良い指標です。骨の島を早期に取り除こうとすると、骨の破片が脳組織に浸透し、硬膜に損傷を与え、炎症や出血を引き起こす可能性があります。 骨島の縁、または上部のコンパクトな骨層をつかむべき細かい鉗子のペアを使用して骨の島を取り除く(図6A)。生理的に浸した外科用スポンジを塗布して、脳を湿らせておく。出血が観察された場合は、出血している領域に外科用スポンジを置きます。出血が止まるまで次のステップに進まないでください。注:5分後に出血が続く場合、動物は多光子イメージング実験に使用できません。ラットの場合、硬膜が厚い場合は、硬膜を除去する必要がある場合がある。硬膜を除去するには、操作顕微鏡に高い倍率と一対の細かい鉗子を使用してください。 頭蓋窓を配置するには、鉗子のペアでガラスカバースリップを拾い、片側に生理焼言を一滴置き、頭蓋骨の穴の上に操縦します。カバースリップの下に気泡がないことを確認します。注:マウスには5mmのガラスカバースリップ、ラットには8mmを使用してください。ラットの場合、頭蓋骨の厚さのために、カバースリップと脳の間のスペースを埋めるために生理液の代わりにアガロース溶液を使用する。トランスデューサーとそのカバースリップは、頭蓋窓に別のカバースリップを使用する代わりに、頭蓋骨に直接付着させることもできます。このオプションでは、ステップ 3.1 に進みます。詳細については 、図1 を参照してください。 シアノアクリル酸接着剤の層をカバースリップの周囲に広げ(図6B)、頭蓋骨に取り付けます。カバースリップの下に接着剤がないことを確認します。接着剤が脳に接触しないように、カバースリップに圧力をかける。 接着剤が完全に乾燥したら、歯科ドリルを使用して接着剤の表面を出します。すべての接着剤の破片が外科領域から取除かれていることを確認してください。注意:慢性の頭蓋窓の場合は、必要な外科後の薬剤(材料表を参照)を注入し、創傷ケアとソフトフード用の軟膏を提供し、ヒートランプの下で動物を回復します。 3. リングトランスデューサの配置 1%(w/v)アガロース溶液を準備します。小さなビーカーまたはアーレンマイヤーフラスコに、0.1 gのアガロースと 10 mL の PBS (1x) または生理液を加えます。アガロースがホットプレートにビーカーを置くか、電子レンジ(30〜45 s)で溶液を加熱することによって完全に溶解するまで溶液を沸騰させます。 手順 3.2 ~ 3.5 は、アガロース溶液が急速に冷却されるため、時間に敏感です。1 mL シリンジにアガロースの 0.5 mL を引き出します。注:脳の完全性を保護するために、アガロースの温度が使用前に体温に近いものであることを確認してください。 アガロースを頭蓋窓のカバースリップに自由に堆積させます。注:組織がブランチする場合、アガロースの温度が高すぎました。動物は安楽死させなければならない。脳を覆う別のカバースリップがない場合(すなわち、トランスデューサーとそのカバースリップは、脳に直接配置され、ステップ2.14を参照)、アガロースはこのステップで脳の表面に沈着する必要があります。 トランスデューサを頭蓋窓の上に置きます(図6C)。トランスデューサーと頭蓋窓の間にアガロースが最小限になるようにしっかりとした圧力をかける。トランスデューサが中心(XY平面)であり、頭蓋骨窓に平行(Z平面)であり、アガロースに気泡がないことを確認します。 アガロースがゼリー様の一貫性に冷却されたら、へらまたはメスを使用してトランスデューサーのカバースリップの周囲から余分なアガロースを切り取る。トランスデューサのカバースリップの下に気泡がないことを確認します。 へらを使用して、トランスデューサのカバースリップの周囲にシアノクリレート接着剤の層を広げ、トランスデューサーが頭蓋骨にしっかりと付着するように頭蓋骨まで延びる。 接着剤が完全に乾燥するまでトランスデューサーにしっかりと圧力を維持します(10-15分)。 4. 多光子顕微鏡イメージング 動物を対物レンズの下に置きます(図7A)。対物レンズがリングトランスデューサの中心に、トランスデューサと平行であることを確認します(図7B)。水浸しの対物レンズを使用する場合は、リングトランスデューサの中心を脱イオン水と脱気水で満たします。注:脱気水は、適切な超音波の伝播のために重要です。 対物レンズを最高位置から開始し、リングトランスデューサ内になるまで対物レンズをゆっくりと下げます(図7A、B)。対物レンズがトランスデューサやカバースリップと衝突しないようにします。注: 接眼レンズを交互に使用して、対物レンズの Z 位置が脳の表面と面内にあるかどうかを確認し、目で、対物レンズがトランスデューサやカバースリップと衝突しないことを確認します。尾静脈を通る蛍光デキストランの注入に続く接眼を通して、pial血管を視覚化することがより容易である場合があります(図7C)。 イメージング用のマルチフォトン顕微鏡を準備します。注:このプロトコルは、直立した多光子顕微鏡と20〜25倍の対物レンズを使用し、2mmの作業距離を持ち、カバースリップを超えて脳の円質子に集中するのに十分です。 デキストランを準備します。メーカーの指示に従って、適切な量のPBSをデキストランのバイアルに追加します。デキストラン溶液を1〜3分間ボルテックスし、デキストラン粉末が完全に溶解していることを確認した。デキストラン溶液を尾静脈に注入します。 イメージ スキャンの設定 接眼レンズを使用して、対物レンズが脳に平行であることを確認します。XZとYZのずれを修正するために動物を傾けます。 多光子顕微鏡で視野を選択します。超音波暴露前にXYZスキャンを設定して、超音波暴露前に脈管構造のベースライン画像を持つ。注:典型的なイメージングパラメータは、深さ300~800μm、ステップサイズ2~5μm、10~20時間のスタックです。撮像シーケンス中に、透きレンズがトランスデューサまたはカバースリップに接触しないようにします。 5. 超音波暴露 すべてのBNCケーブルが正しく接続されていることを確認します(図3)。 超音波マイクロバブル処理の前、中、および後のイメージスタックをキャプチャするのに十分な長さであるXYZTイメージスキャンを設定します。 メーカーの指示に従ってマイクロバブルを準備します。尾静脈にマイクロバブルを注入し、イメージングを開始します。注:マイクロバブル注入は注入ポンプと一貫した注入率を保障し、同時マイクロバブル注入およびイメージ投射を可能にするために行うことができる。イメージング中にマイクロバブルを注入する場合は、検出器を周囲光にさらすことなく、尾静脈に簡単にアクセスできることを確認してください。 超音波処理を開始します。注:典型的な超音波処理パラメータは次のとおりです:10 msサイクル、0.2-0.4の機械的指数、および1〜4 Hz間のパルス繰り返し周波数.前臨床超音波マイクロバブル研究で使用される超音波処理およびマイクロバブルパラメータは広範囲に研究されており、文献に十分に文書化されています(例えば、レビューについては 40 を参照)。 超音波処理の持続期間を通じてマルチフォトンイメージングを継続し、超音波処理の終わりに従います。これはBBB透過性の増加を示すため、血管からの除外に注意してください。注:血管外空間でデキストランが検出されたが、視野の周囲に検出された場合、視野外に血管が影響を受ける可能性があります。これは、対物レンズの焦点を持つトランスデューサのずれから生じる可能性があります。このシナリオでは、トランスデューサを再調整するよりも、対物レンズを動かしたり、動物を再配置したりして、視野を調整する方が簡単です。 画像化が完了したら、深部麻酔またはCO2 窒息下で動物の子宮頸部脱臼を安楽死させる。慢性頭蓋窓の場合は、露出した頭蓋骨に歯科用セメントの層を広げます。メモ:慢性的な頭蓋窓の場合、ステップ2.8で頭皮が取り除かれるため、これは必要ありませんが、窓の周りの皮膚を縫合することができます。 6. 画像解析 イメージ スタックをエクスポートします。 画像解析ソフトウェア(例えば、オリンパスフルオビュー、ImageJ/FIJI、ビットプレーンイマリス、サーモフィッシャーサイエンティフィックアミラ)および/またはプログラミングツール(例えば、Python、MATLAB)を使用して画像を分析します。