원소 이미징을 위한 습지 뿌리와 류스피어를 보존하는 방법
Summary
우리는쌀(Oryza sativa L.)을 모형 종으로 사용하여 습지 환경에서 온전한 뿌리와 주변 의체 토양을 시료, 보존 및 섹션화하는 프로토콜을 설명합니다. 일단 보존되면, 시료는 싱크로트론 X선 형광(XRF) 화학적 분석 영상과 같은 원소 이미징 기술을 사용하여 분석될 수 있다.
Abstract
뿌리는 토양 환경과 광범위하게 상호 작용하지만 뿌리와 주변 뿌리 권 사이의 상호 작용을 시각화하는 것은 도전적입니다. 습지 식물의 뿌리 권 화학 은 뿌리에서 대량 토양에 가파른 산소 그라데이션 때문에 캡처특히 도전이다. 여기서 는 슬램 동결 및 동결 건조를 통해 습지 식물의 뿌리 구조와 뿌리 권 화학을 효과적으로 보존하는 프로토콜이 설명되어 있습니다. 액체 질소로 미리 냉각된 구리 블록 사이에 시료가 동결되는 슬램 동결은 화학 적 분석 변화를 최소화하면서 플래시 동결로 발생할 수있는 뿌리 손상 및 샘플 왜곡을 최소화합니다. 샘플 왜곡은 여전히 가능하지만, 비용을 최소화하면 여러 샘플을 신속하게 얻을 수 있는 능력이 만족스러운 샘플을 얻을 수 있는 잠재력을 증가시키고 이미징 시간을 최적화합니다. 데이터는 이 방법이 철 플라크와 관련된 쌀 뿌리와 뿌리 줄기권에서 감소 된 비소 종을 보존하는 데 성공한다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 미량 원소 사이클링에서 식물 치료 응용 프로그램에 이르기까지 농도 범위에 걸쳐있는 다양한 습지 환경에서 식물 토양 관계의 연구를 위해 채택 될 수있다.
Introduction
뿌리와 뿌리는 동적, 이질성, 식물이 미네랄 영양소와 오염 물질을 얻는 방법을 이해하는 데 매우 중요합니다1,2,3. 뿌리는 영양분(예를 들어, 인) 및 오염물질(예를 들어, 비소)이 토양에서 식물로 이동하여 이 과정을 이해하는 것이 식품량과 품질, 생태계 기능 및 식물 치료에 영향을 미치는 주요 경로입니다. 그러나, 뿌리는 영양 취득 요구에 대응하여 성장하는 공간과 시간에 역동적이며, 종종 기능, 직경 및 구조(예를 들어, 측면 뿌리, 출현 뿌리, 뿌리)2. 루트 시스템의 이질성은 세포에서 생태계 수준으로 공간 적 척도와 시간당에서 디칼까지의 시간적 척도에서 연구할 수 있습니다. 따라서 뿌리와 주변 토양 또는 뿌리권의 동적이고 이질적인 특성은 시간이 지남에 따라 뿌리 권 화학을 포착하는 데 어려움을 겪습니다. 이 도전에도 불구하고, 이 중요한 식물 토양 관계를 특성화하기 위해 토양 환경에서 뿌리를 연구하는 것이 필수적입니다.
습지 식물의 뿌리 권 화학 때문에 공간과 시간의 변화 뿌리에 대량 토양에서 존재하는 가파른 산소 그라데이션의 조사를 특히 도전한다. 뿌리는 호흡산소가 필요하기 때문에 습지 식물은4,5를생성하여 습지 토양의 낮은 산소 조건에 적응했다. Aerenchyma는 싹에서 뿌리까지 확장되는 속이 빈 피질 조직으로 식물을 통해 뿌리를 통해 공기가 확산될 수 있습니다. 그러나, 이 공기중 일부는 뿌리의 덜 구불 한 부분에서 뿌리의 덜 구불 한 부분에서 뿌리로 누출 특히 측면 루트 접합, 덜 성숙한 루트 팁 및 신장 영역6,7,8,9. 이러한 방사형 산소 손실은 습지 식물의 뿌리 부각에 산화된 영역을 생성하여 뿌리근구(bio-geo) 화학에 영향을 미치고 감소된 벌크토양(10,11,12)과구별된다. 습지 뿌리 부각과 뿌리에서 영양분과 오염 물질의 운명과 수송을 이해하기 위해 화학적으로 감소 된 대량 토양, 산화 된 뿌리 권, 분석을 위한 습지 식물의 뿌리를 보존하는 것이 중요합니다. 그러나, 벌크 토양은 산소에 민감한 감소 된 토양 성분을 포함하기 때문에, 뿌리 및 토양 보존 방법은 뿌리 구조를 보존하고 산소에 민감한 반응을 최소화해야합니다.
식물 조직을 고치고 이미징을 위한 초구조를 보존하는 방법은 존재하지만, 이러한 방법은 습지 토양에서 자라는 뿌리를 화학적으로 보존하기 위해 적용될 수 없습니다. 식물 세포 내의 원소 분포만 원하는 조사를 위해 식물은 일반적으로 수력으로 재배되고 뿌리는 용액에서 쉽게 제거될 수 있으며, 고압 동결 및 동결 치환하에서 고정되어 고해상도 이차 이온 질량 분석법(nanoSIMS), 전자 현미경 검사, 싱크로트론 X선 형광(SRF)을 포함한 다양한 이미징 응용 분야에 대해 단면화될 수 있습니다. 14,15. 습지 뿌리 의 외부에 Fe 플라크를 조사하기 위해, 이러한 수경 연구는 인위적으로 솔루션16에서Fe 플라크 형성을 유도해야 하며, 이는 태아 플라크 형성 및 관련 원소의 분포 및 광물 조성의 이질성을 정확하게 나타내지 않는17,18,19,20. 습지 토양 및 관련 미생물을동결-코링(21)으로보존하는 방법이 존재하지만, 이 기술로 뿌리를 얻기는 어렵다. 토양에서 자라는 뿌리와 그 류강포화학을 시각화하는 현재의 방법은 원소 플럭스와 총 원소 농도(및 표본)의 두 가지 기본 측정 유형으로 구성됩니다. 전자는 전형적으로 토양이 체형 층으로 확산되는 실험실 설정 및 비핵 원소에서 식물 성장을 지원하기 위해 뿌리 줄기상자에 토양을 배치하는 박막(DGT)22,23,24에서확산 그라데이션을 사용하여 측정된다. 그런 다음 이 바인딩 레이어를 이미지하여 관심 있는 음순 요소를 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 뿌리와뿌리 권구(24,25,26,27)사이의 관계를 성공적으로 설명할 수 있지만 뿌리 경계에서 나온 유물은 뿌리 뿌리 상자에서 식물을 재배하여 존재할 수 있으며, 뿌리 내부에 대한 정보는 DGT로 캡처되지 않는다. 후자는 뿌리와 뿌리 부류의 샘플링, 샘플을 보존하고 샘플 섹션의 원소 분포를 직접 분석하는 것을 포함한다. 습지 식물 뿌리와 주변 뿌리의 환경 샘플링을 위해 시료 준비에서 유물을 피하기 위해 신중한 샘플 처리가 필요합니다.
여기서 는 습지 식물의 뿌리 구조와 뿌리 권 화학을 효과적으로 보존하여 건조를 동결하고 동결시키는 프로토콜이 설명되어 있습니다. 플래시 동결은 산소에 민감한 솔루트의 변형을 크게 늦출 수 있지만 뿌리를 손상시킬 수 있으며 샘플이 건조될 때 동원될 수 있습니다. 그러나 액체 질소로 미리 냉각된 구리 블록 사이에 시료가 동결되는 슬램 동결은 뿌리 손상과 샘플왜곡(28)을최소화한다. 보존된 견본은 그 때20,29로 보존하고 그들의 뿌리의 화상 진찰을 위해 절단되고 연마될 수 있는 에폭시 수지에 내장됩니다. 이 보고서의 샘플은 얇은 단면 후 S-XRF 화학 적 분석 이미징에 의해 분석되었다. 그러나 레이저 절제-유도 결합 된 플라즈마 질량 분광법 (LA-ICP-MS), 입자 유도 X 선 방출 (PIXE), 이차 이온 질량 분광법 (SIMS), 레이저 유도 고장 분광법 (LIBS) 이미징을 포함하여 다른 이미징 기술이 사용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 원소 이미징 및/또는 화학 적 분석 매핑에 사용할 수있는 슬램 동결 기술을 사용하여 습지 식물 뿌리의 보존 된 벌크 토양 + 뿌리 줄기를 얻는 프로토콜을 설명합니다.
기존 메서드에 비해 이 메서드의 몇 가지 이점이 있습니다. 첫째, 이 방법은 뿌리와 주변 뿌리권에 대한 동시 조사를 허용한다. 현재 토양을 씻어내고?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 델라웨어 대학과 브룩헤이븐 국립 연구소 사이의 협력을 지원하기 위해 세이퍼스와 타페로에 공동 종자 보조금을 인정합니다. 이 연구의 일부는 국가 싱크로트론 광원 II의 XFM (4-BM) 빔 라인을 사용, 미국 에너지부 (DOE) 과학 사용자 시설의 사무실은 계약 번호에서 브룩 헤이븐 국립 연구소에 의해 과학의 DOE 사무실을 위해 운영. DE-SC0012704.
Materials
| Copper blocks | McMaster Carr | 89275K42 | |
| Diamond blade | Buehler | 15 LC, 102 mm x 0.3 mm | operation speed: 225 rpm |
| Epoxy forms | Struers | 40300085 | FixiForm |
| Epoxy | Epotek | 301-2FL | |
| Superglue | Loctite | 404 | |
| Thin sectioning machine | Buehler | PetroThin | |
| Wet saw | Buehler | IsoMet 1000 |
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