Herpes Simpleks Virüs-1 Antivirallerinin Etkinliğini İncelemek için Porcine Kornea Dokusu Eksplant
Summary
Deneysel ilaçların antiviral etkinliğini test etmek için bir porcine korneasının kullanımını açıklıyoruz.
Abstract
Virüsler ve bakteriler kornea enfeksiyonu yoluyla çeşitli oküler yüzey kusurlarına ve yaralar ve ülserler gibi dejenerasyona neden olabilir. Dünya çapında% 60-90 arasında değişen bir seroprevalans ile, Herpes Simpleks Virüs tip-1 (HSV-1) genellikle lezyonlar ve enfeksiyon ilişkili körlük olarak da kendini gösteren orofasiyal bölgenin mukokütanöz lezyonlarına neden olur. Mevcut antiviral ilaçlar etkili olmakla birlikte, toksik yan etkilerin direncinin ortaya çıkması ve kalıcılığı, bu her yerde bulunan patojene karşı yeni antivirallerin geliştirilmesini gerektirir. In vitro değerlendirme, ortaya çıkan bir antiviral ile ilgili bazı fonksiyonel veriler sağlasa da, in vivo oküler dokunun karmaşıklığını göstermez. Bununla birlikte, in vivo çalışmalar pahalıdır ve özellikle viral ajanlarla çalışırken eğitimli personel gerektirir. Bu nedenle ex vivo modelleri antiviral test için verimli ancak ucuz adımlardır. Burada, HSV-1’in porcine kornea ex vivo kullanarak enfeksiyonu incelemek için bir protokol ve mevcut ve yeni antiviral ilaçları kullanarak topikal olarak tedavi etmek için bir yöntem tartışıyoruz. Ayrıca HSV-1 kullanarak bir plak tahlilini gerçekleştirme yöntemini de gösteriyoruz. Ayrıntılı yöntemler, HSV-1 patojenine benzeyen enfeksiyonları incelemek için benzer deneyler yapmak için kullanılabilir.
Introduction
Oküler enfeksiyonlardan muzdarip insanlar genellikle görme kaybına maruz1. Dünya çapında yüksek seroprevalans ile, HSV enfekte bireyler kornea skarlaşmasına, stromal keratit ve neovaskülarizasyona yol açan tekrarlayan göz enfeksiyonlarından muzdariptir2,3,4,5. HSV enfeksiyonlarının da daha az sıklıkta, ensefalit ve sistemik morbidite6,7,8gibi immün sistemik olarak tedavi edilmemiş hastalar arasında bir dizi ciddi duruma neden olduğu gösterilmiştir. Acyclovir (ACV) ve nükleozid analogları gibi ilaçlar HSV-1 enfeksiyonunu frenlemede ve hatta yeniden etkinleştirmeyi kontrol etmede tutarlı bir başarı göstermiştir, ancak bu ilaçların uzun süreli kullanımı böbrek yetmezliği, fetal anormallikler ve gelişen viral suşlara karşı ilaç direncinin ortaya çıkmasını kısıtlamama ile ilişkilidir9,10,11,12,13. HSV-1 oküler enfeksiyonlarla ilişkili karmaşıklıklar, daha önce monolayerler ve insan kornea hücrelerinin 3D kültürleri kullanılarak in vitro ve murine veya tavşan oküler enfeksiyonları kullanılarak in vivo olarak çalışılmıştır. Bu in vitro modeller HSV-1 enfeksiyonlarının hücresel biyolojik bileşenleri hakkında önemli veriler sağlarken, kornea dokusunun karmaşık karmaşıklığını taklit edemezler ve virüsün dendritik yayılımını aydınlatmak için çok az şeyyaparlar 14. Buna karşılık, in vivo sistemler HSV-1 enfeksiyonu sırasında kornealarda enfeksiyon yayılımını ve immün aktivasyon yanıtlarını göstermede daha anlayışlı olsalar da, deneyleri göz ardı etmek için eğitimli araştırmacılara ve hayvan bakımı için büyük tesislere ihtiyaç duydukları uyarısıyla birlikte gelirler.
Burada HSV-1 enfeksiyon kaynaklı yara sistemini incelemek için ek vivo model olarak porcine korneaları kullanıyoruz. Hem bazı ilaçların potansiyel farmakolojisi hem de enfeksiyonun neden olduğu yara sisteminin hücre ve moleküler biyolojisi doku eksplant kültürleri üzerinden incelenebilir. Bu model diğer viral ve bakteriyel enfeksiyonlar için de kullanılabilir. Bu çalışmada, preklinik küçük bir molekül olan BX795’in antiviral etkinliğini test etmek için porsin korneaları kullanılmıştır. Erişim kolaylığı ve maliyet etkinliği nedeniyle porcine kornea kullanımı tercih edildi. Ek olarak, porcine kornea modelleri, korneaların izole edilmesi kolay, enfeksiyon ve görselleştirme için yeterli boyutta ve15’iidare etmek için sağlam olan iyi insan gözleri modelleridir. Porcine korneaları ayrıca hem trans kornea geçirgenliği hem de sistemik emilim15‘te insan kornea modellerinin karmaşıklığı ile karşılaştırılabilir. Çalışma için bu modeli kullanarak, BX795’in HSV-1 virüs enfeksiyonunun yetkin bir inhibitörü olarak nasıl daha fazla araştırmaya layık olduğunu ve potansiyel bir küçük moleküllü antiviral bileşik olarak sınıflandırma literatürüne eklediğini ortaya çıkarabildik16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceki araştırmalar BX795’in HSV-1 enfeksiyonuna karşı antiviral ajan olarak umut verici bir role sahip olduğunu göstermiştir; TANK bağlayıcı kinaz 1 (TBK1)16’yıinhibe ederek. Hem TBK1 hem de otofaji, insan kornea epitel hücrelerinde gösterildiği gibi HSV-1 enfeksiyonunu inhibe etmeye yardımcı olmuştur. BX795’in 10μM konsantrasyonda antiviral aktivite ile maksimum derecede etkili olduğu ve hem batı leke analizi hem de anahtar viral proteinlerin viral plak analizi kullanılarak…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibeleri (R01 EY024710, RO1 AI139768 ve RO1 EY029426) tarafından D.S. A.A.’ya verilen F30EY025981 hibesi ile desteklendi. Çalışma, Park Ambalaj şirketi, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609’dan elde edilen porcine korneaları kullanılarak gerçekleştirildi.
Materials
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper – 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers –80 °C. – | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | – | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium – ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium – MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | 0 | Special order by request |
| Procedure bench covers – as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
Referencias
- Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
- Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).
- Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. The role of herpesviruses in ocular infections. Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).
- Xu, F., et al. Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).
- Xu, F., et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).
- Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections. Microorganisms. 7 (10), (2019).
- Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation. Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).
- Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).
- Lass, J. H., et al. Antiviral medications and corneal wound healing. Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).
- Burns, W. H., et al. Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy. Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).
- Crumpacker, C. S., et al. Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir. New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).
- Yildiz, C., et al. Acute kidney injury due to acyclovir. CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).
- Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
- Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559 (2017).
- Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
- Jaishankar, D., et al. An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye. Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
