Explante de tejido corneal porcino para estudiar la eficacia de los antivirales del virus del herpes simple-1
Summary
Describimos el uso de una córnea porcina para probar la eficacia antiviral de los fármacos experimentales.
Abstract
Los virus y las bacterias pueden causar una variedad de defectos de la superficie ocular y degeneración, como heridas y úlceras a través de la infección corneal. Con una seroprevalencia que oscila entre el 60-90% en todo el mundo, el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) comúnmente causa lesiones mucocutáneas de la región orofacial que también se manifiestan como lesiones y ceguera asociada a la infección. Si bien los medicamentos antivirales actuales son efectivos, la aparición de resistencia y la persistencia de efectos secundarios tóxicos requiere el desarrollo de nuevos antivirales contra este patógeno ubicuo. Aunque la evaluación in vitro proporciona algunos datos funcionales con respecto a un antiviral emergente, no demuestran la complejidad del tejido ocular in vivo. Sin embargo, los estudios in vivo son costosos y requieren personal capacitado, especialmente cuando se trabaja con agentes virales. Por lo tanto, los modelos ex vivo son pasos eficientes pero económicos para las pruebas antivirales. Aquí discutimos un protocolo para estudiar la infección por HSV-1 utilizando córneas porcinas ex vivo y un método para tratarlas tópicamente utilizando medicamentos antivirales existentes y nuevos. También demostramos el método para realizar un ensayo de placa utilizando HSV-1. Los métodos detallados se pueden utilizar para realizar experimentos similares para estudiar infecciones que se asemejan al patógeno HSV-1.
Introduction
Las personas que sufren de infecciones oculares a menudo incurren en pérdida de la visión1. Con una alta seroprevalencia en todo el mundo, los individuos infectados por el VHS sufren infecciones oculares recurrentes que conducen a cicatrices corneales, queratitis estromal y neovascularización2,3,4,5. Las infecciones por VHS también han demostrado causar con menos frecuencia, una variedad de afecciones graves entre pacientes inmunocomprometidos y no tratados, como encefalitis y morbilidad sistémica6,7,8. Medicamentos como el aciclovir (ACV) y sus análogos de nucleósidos han demostrado un éxito constante en la reducción de la infección por HSV-1 e incluso la reactivación de control, sin embargo, el uso prolongado de estos medicamentos se asocia con insuficiencia renal, anomalías fetales y la incapacidad de restringir la aparición de resistencia a los medicamentos a las cepas virales en evolución9,10,11,12,13. Las complejidades asociadas a las infecciones oculares por HSV-1, han sido previamente estudiadas in vitro utilizando monocapas y cultivos 3D de células corneales humanas e in vivo utilizando infecciones oculares murinas o de conejo. Si bien estos modelos in vitro proporcionan datos significativos sobre los componentes biológicos celulares de las infecciones por HSV-1, sin embargo, no logran imitar la intrincada complejidad del tejido corneal y hacen poco para iluminar la propagación dendrítica del virus14. En contraste, aunque los sistemas in vivo son más perspicaces al mostrar la propagación de la infección en las córneas y las respuestas de activación inmune durante la infección por HSV-1, vienen con la advertencia de que requieren investigadores capacitados y grandes instalaciones para el cuidado de animales para pasar por alto los experimentos.
Aquí utilizamos córneas porcinas como modelo ex vivo para examinar el sistema de heridas inducidas por infección por HSV-1. Tanto la farmacología potencial de ciertos fármacos como la biología celular y molecular del sistema de heridas causado por la infección se pueden estudiar a través de cultivos de explantes de tejidos. Este modelo también puede ser modificado para el uso de otras infecciones virales y bacterianas también. En este estudio, se utilizaron córneas porcinas para probar la eficacia antiviral de una molécula pequeña preclínica, BX795. Se prefirió el uso de córneas porcinas debido a la facilidad de acceso y la rentabilidad. Además, los modelos de córnea porcina son buenos modelos de ojos humanos con las córneas siendo fáciles de aislar, de tamaño adecuado para la infección y visualización y robustas para manejar15. Las córneas porcinas también son comparables a la complejidad de los modelos corneales humanos tanto en permeabilidad trans corneal como en absorción sistémica15. Al usar este modelo para el estudio, pudimos dilucidar cómo BX795 es digno de una mayor investigación como un inhibidor competente de la infección por el virus HSV-1 y se suma a la literatura de clasificarlo como un posible compuesto antiviral de molécula pequeña16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Investigaciones anteriores han demostrado que BX795 tiene un papel prometedor como agente antiviral contra la infección por HSV-1; inhibiendo la quinasa de unión a TANK 1 (TBK1)16. Tanto TBK1 como la autofagia han desempeñado un papel en ayudar a inhibir la infección por HSV-1, como se ha demostrado en las células epiteliales corneales humanas. BX795 demostró ser máximamente efectivo con actividad antiviral a una concentración de 10μM y utilizando tanto el análisis de western blot como e…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por subvenciones de los NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 y RO1 EY029426) a D.S. A.A. fue apoyado por una subvención F30EY025981 del Instituto Nacional del Ojo, NIH. El estudio se realizó utilizando las córneas porcinas obtenidas de Park Packing company, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609
Materials
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper – 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers –80 °C. – | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | – | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium – ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium – MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | 0 | Special order by request |
| Procedure bench covers – as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
Referencias
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