インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

ミオシンは、アデノシン三リン酸(ATP)加水分解に由来するエネルギーを用いてアクチンフィラメントに力を発揮する運動タンパク質^である。ミオシンには頭、首、尾のドメインが含まれています。ヘッドドメインは、ATP結合および加水分解の部位と同様にアクチン結合領域を含む。首のドメインは、軽鎖、カルモジュリン、またはカルモジュリン様タンパク質^2、3に結合するIQモチーフで構成されています。尾部領域は、ミオシンの各クラスに特有のいくつかの機能を有し、2つの重鎖の二量体化、貨物分子の結合、およびヘッドドメイン¹との自己抑制相互作用によるミオシンの調節を含むがこれらに限定されない。

ミオシンの運動特性はクラスによって大きく異なります。これらの特性の一部は、義務比(ミオシンがアクチンに結合しているミオシンの機械的周期の割合)およびプロセス性(剥離前にそのトラック上で複数のステップを行うモーターの能力)を含む^4。40以上のミオシンクラスは、配列解析^{5、6、7、8}に基づいて決定された。クラス2ミオシンは、最初に研究されたので、「従来」に分類されます。したがって、ミオシンの他のすべてのクラスは、「型破り」に分類されます。

ミオシン5a(M5a)はクラス5ミオシンであり、プロセスモーターであり、解離する前にアクチンに沿って複数のステップを取ることができることを意味する。これは、高いデューティ比を有し、その機械的サイクルの大部分をアクチン9、10、11、12、13、14に結合して費やしていることを示している。他のミオシンと共通して、重鎖はアクチン結合およびATP加水分解部位の両方を含むN末端モータードメインを含み、続いてレバーアームとして機能する首領域を含み、本質的な軽鎖(ELC)およびカルモジュリン(CaM)15に結合する6つのIQモチーフを有する。尾部領域にはαらせんコイルコイルが含まれており、分子を二量体化し、続いて貨物を結合するための球状尾部領域が続きます。その運動論は、メラノサイトにおけるメラノソームの輸送およびプルキンジェニューロン^16,17における小胞体の輸送への関与を反映している。M5aは原型貨物輸送モータ¹⁸と考えられている。

クラス2ミオシン、または従来のミオシンは、非筋筋ミオシン2(NM2)アイソフォームに加えて骨格、心臓、平滑筋の収縮に力を与えるミオシン、NM2a、2b、および2c¹⁹を含む。NM2アイソフォームは、全ての細胞の細胞質に見出され、サイトカネシス、接着、組織形態形成、および細胞遊マイグレーション^{19、20、21、22}において役割を共有している。本論文では、非筋ミオシン2b(NM2b)23の文脈における従来のミオシンプロトコルについて論議する。NM2bは、M5aと比較して、低いデューティ比を有し、0.2 s^-123の_VmaxのVを有する酵素的に遅い≈18 s^-124のM5aのV_maxと比較した。特に、2つのヘッドを持つ切り捨てられたNM2bコンストラクトは、アクチン上で処理的に容易に移動しません。むしろ、アクチンとの出会いのたびに、パワーストロークが発生し、その後に分子²⁵が解離される。

NM2bには2つのミオシン重鎖が含まれ、それぞれに1つの球状頭ドメイン、1つのレバーアーム(ELCと1つの調節軽鎖(RLC))、およびαヘリカルコイルコイルロッド/テールドメイン(約1,100アミノ酸長)が含まれ、これら2つの重鎖を二量体化します。NM2bの酵素活性および構造状態は、RLC²³のリン酸化によって調節される。非リン酸化NM2bは、ATPおよび生理的イオン強度(約150mM塩)の存在下で、2つの頭部が非対称相互作用に関与し、尾部が²³の2箇所で頭の上に折り畳まれるコンパクトな立体構造を採用している。この状態では、ミオシンはアクチンと強く相互作用せず、酵素活性が非常に低い。カルモジュリン依存性ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)またはRho関連プロテインキナーゼによるRLCリン酸化の際、その分子は尾部を通して他のミオシンと結合して、約30個のミオシン分子²³の双極性フィラメントを形成する。RLCの前述のリン酸化はまた、NM2bのアクチン活性化ATPase活性を約4倍の^26、27、28に増加させる。このバイポーラフィラメントの配置は、各端に多くのミオシンモーターを搭載し、収縮および張力維持における役割に最適化されており、対立する極性を有するアクチンフィラメントを互いに^23,29に対して相対的に移動させることができる。したがって、NM2bはアクチンと相互作用する際にモータのアンサンブルとして機能することが示されている。このフィラメント内の多数のモータにより、NM2bフィラメントはアクチンフィラメント上でプロセス的に移動でき、インビトロフィラメントの加工性を²⁹を特徴付け可能にする。

細胞内のミオシンの役割を理解する上で進歩が見られましたが、タンパク質レベルで個々の特性を理解する必要があります。細胞内ではなく、単純なタンパク質とタンパク質相互作用レベルでのアクトミオシン相互作用を理解するために、インビトロ研究で使用するために組み換えミオシンを発現し、精製することができます。このような研究の結果は、メカノバイオスレーターに、最終的に複雑な細胞プロセスを駆動する特定のミオシンの生物物理学的性質について知らせる^12,13^,14,^25,29.通常、これは、全長または切り捨てられたミオシンコンストラクトにアフィニティタグを追加し、アフィニティークロマトグラフィー^29、30、31を介して精製することによって達成される。さらに、この構築物は、遺伝的にエンコエーブルなフルオロフォアまたは合成フルオロフォアでのタンパク質標識用のタグを含むように設計することができる。このような蛍光標識を添加することにより、ミオシン力学および運動学を観察する単一分子イメージング研究が行える。

精製後、ミオシンは、いくつかの方法で特徴づけることができる。ATPase活性は、異なる条件³²の下でモータの全体的なエネルギー消費量とアクチン親和性についての洞察を提供する、色分け法によって測定することができる。その運動性のメカノケミストリーについて学ぶためには、さらなる実験が必要です。本論文では、精製ミオシンタンパク質の運動特性を特徴付けるために使用できる2つのin vitro蛍光顕微鏡ベースの方法について詳しく述べています。

これらの方法の第1は、滑空アクチンフィラメントアッセイであり、ミオシンモータのアンサンブル特性を定量的に研究し、精製タンパク質³³のバッチの品質を定性的に研究することができる。本論文では、本アッセイに対する全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡の使用について論じるが、これらの実験は、多くの研究室³⁴に広く見られるデジタルカメラを搭載した広視野蛍光顕微鏡を用いて効果的に行うことができる。このアッセイでは、ミオシンモータの飽和層がカバースリップに取り付けられています。これはニトロセルロース、抗体、膜、SiO2-誘導体化表面(トリメチルクロロシランなど)を用いて達成できるが、とりわけ29、33、35、36、37、38。蛍光標識アクチンフィラメントはカバースリップチャンバーを通過し、その上にアクチンが表面に付着したミオシンに結合する。ATP(およびNM2の研究におけるキナーゼ)を添加すると、チャンバーは、表面結合ミオシンによるアクチンフィラメントの転位を観察するために画像化される。トラッキングソフトウェアは、各滑空アクチンフィラメントの速度と長さを相関させるために使用することができます。解析ソフトウェアは、移動型および静止型アクチンフィラメントの数の測定値を提供することもできるため、所定のミオシン製剤の品質を判断するのに有用である可能性があります。失速したフィラメントの割合は、アクチンの表面テザリングによって他のタンパク質に対する意図的に変調し、ミオシン³⁹の負荷依存性を決定するために測定することもできる。各アクチンフィラメントは多数の利用可能なモータによって推進できるため、このアッセイは非常に再現性が高く、最終的な測定速度は、開始ミオシン濃度の変化や溶液内の追加の因子の存在などの摂動に強い。これは、変化したリン酸化、温度、イオン強度、溶液粘度、表面テザーによって誘発される負荷の影響など、異なる条件下でミオシン活性を研究するために容易に変更できることを意味します。ATP加水分解ができない強結合ミオシン「デッドヘッド」などの要因は、アクチンフィラメントの停滞を引き起こす可能性がありますが、そのような問題を軽減し、正確な測定を可能にする複数の方法があります。ミオシンの運動特性はクラスによって大きく異なり、使用される特定のミオシンに応じて、このアッセイにおけるアクチンフィラメント滑空の速度は20 nm/s(ミオシン^9)40、41、および60,000nm/s(シャラセアンミオシン11)42の下で変化する可能性がある。

第2アッセイは、滑空アクチンフィラメントアッセイ¹²の幾何学を反転させる。ここで、アクチンフィラメントはカバースリップ表面に付着しており、M5aの単一分子またはNM2bの個々の双極性フィラメントの動きが可視化される。このアッセイは、アクチン上の単一のミオシン分子またはフィラメントの実行長および速度を定量化するために使用することができる。カバースリップは、非特異的結合をブロックし、同時にビオチンポリエチレングリコール(ビオチン-PEG)などの表面を機能させる化学化合物でコーティングされています。修飾アビジン誘導体の添加は、表面を素数化し、ビオチン化アクチンがチャンバーを通過し、チャンバーの底に安定して結合したF-アクチンの層をもたらす。最後に、活性化および蛍光標識ミオシン(通常1-100 nM)がチャンバーを流れ、次いで静止したアクチンフィラメント上のミオシンの動きを観察するために画像化される。

これらのモダリティは、非筋肉と筋ミオシンの両方のダイナミクスを調べるために採用することができる迅速かつ再現可能な方法を表します。本報告書は、M5aとNM2bの両方を精製し、特徴付ける手順を概説し、それぞれ非伝統的なミオシンを表す。その後、ミオシン特異的な適応の一部について議論が行われ、2種類のアッセイで動きのキャプチャを成功させるために行うことができる。

発現・分子生物学
対象のミオシンのcDNAは、M5a-HMMを発現する場合はC末端FLAGタグ(DYKDDDK)、またはNM2b^{23、43、44、45、46}の全長分子を発現する場合はN末端FLAGタグのために符号化する修正されたpFastBac1ベクターにクローン化されなければならない。NM2b上のC末端FLAGタグは、FLAG-アフィニティーカラムに対するタンパク質の親和性が弱くなります。対照的に、N末端FLAGタグ付きタンパク質は、通常、FLAGアフィニティーカラム²³によく結合する。N末端にタグ付けされたタンパク質は、酵素活性、機械的活性およびリン酸化依存性調節²³を保持する。

本論文では、フラグタグとミオシン重鎖のC末語との間にGFPを有する切り捨てられたマウスM5a重メロミオシン(HMM)様の構造を用いた。NM2bとは異なり、M5a-HMMはN端子またはC端子FLAGタグで正常にタグ付けおよび精製することができ、どちらの場合も結果として得られる構成体がアクティブになることに注意してください。M5a重鎖はアミノ酸1090で切り捨てられ、M5a47のGFPとコイルコイル領域との間に3つのアミノ酸リンカー(GCG)を含む。GFP と FLAG タグの間にリンカーが追加されなかった。M5a-HMMはカルモジュリンと共に発現した。全長ヒトNM2b構築物をELCおよびRLCと共に発現した。RLCのN末語を5アミノ酸のリンカーを介してGFPと融合した(SGLRS)。FLAGタグに直接アタッチされたのはハロタグでした。ハロタグとミオシン重鎖のN末語との間には、2つのアミノ酸(AS)からなるリンカーであった。

両方のミオシン製剤を、約2 x 10⁶細胞/mLの密度でバキュロウイルスに感染したSf9細胞培養物の1リットルから精製した。各サブユニットのバキュロウイルスの量は、メーカーの指示によって決定されるウイルスの感染の多重度に依存した。M5aの場合、細胞はカルモジュリン用の2つの異なるバキュロウイルス1とM5a重鎖用の1つを共感染した。NM2bの場合、細胞はELC用の3つの異なるウイルス1、RLC用、NM2b重鎖用のウイルス1種と共感染した。多様なミオシン(または他の多複雑なタンパク質)を扱うラボでは、重鎖と軽鎖の多くの組み合わせを可能にし、カルモジュリンなどの一般的に使用される軽鎖は、多くの異なるミオシン重鎖と共にトランスフェクションすることができるので、このアプローチは効率的です。すべての細胞作業は、汚染を避けるために適切な滅菌技術を備えたバイオセーフティキャビネットで完了しました。

M5aおよびNM2bの両方の発現に関して、組換えミオシンを産生する Sf9 細胞を感染後2〜3日回収し、遠心分離を介して、−80°Cで保存した。 細胞ペレットは、2,800 x gで30分間4°CでコフェクトされたSf9細胞を遠心した。タンパク質精製プロセスについて、以下で詳しく説明します。