Adaptations spécifiques à la myosine des tests de motilité basés sur la microscopie à fluorescence in vitro

Les myosines sont des protéines motrices qui exercent une force sur les filaments d’actine en utilisant l’énergie dérivée de l’hydrolyse de l’adénosine triphosphate (ATP)^1. Les myosines contiennent un domaine de la tête, du cou et de la queue. Le domaine principal contient la région de liaison à l’actine ainsi que le site de liaison et d’hydrolyse de l’ATP. Les domaines du cou sont composés de motifs IQ, qui se lient à des chaînes légères, à la calmoduline ou à des protéines de type calmoduline^2,3. La région de la queue a plusieurs fonctions spécifiques à chaque classe de myosines, y compris, mais sans s’y limiter, la dimérisation de deux chaînes lourdes, la liaison des molécules de cargaison et la régulation de la myosine via des interactions auto-inhibitoires avec les domaines de la tête¹.

Les propriétés mobiles de la myosine varient considérablement d’une classe à l’autre. Certaines de ces propriétés comprennent le rapport de service (la fraction du cycle mécanique de la myosine dans laquelle la myosine est liée à l’actine) et la processivité (la capacité d’un moteur à effectuer plusieurs pas sur sa voie avant le détachement)⁴. Les plus de 40 classes de myosines ont été déterminées sur la base d’analyses de^{séquences 5,6,7,8}. Les myosines de classe 2 sont classées comme « conventionnelles » puisqu’elles ont été les premières à être étudiées ; toutes les autres classes de myosines sont donc classées comme « non conventionnelles ».

La myosine 5a (M5a) est une myosine de classe 5 et est un moteur processif, ce qui signifie qu’elle peut prendre plusieurs étapes le long de l’actine avant de se dissocier. Il a un rapport de service élevé, indiquant qu’il passe une grande partie de son cycle mécanique lié à l’actine^{9,10,11,12,13,14}. Comme d’autres myosines, la chaîne lourde contient un domaine moteur N-terminal qui comprend à la fois un site d’hydrolyse de liaison à l’actine et un site d’hydrolyse de l’ATP, suivi d’une région du cou qui sert de bras de levier, avec six motifs IQ qui se lient aux chaînes légères essentielles (ELC) et à la calmoduline (CaM)¹⁵. La région de la queue contient des bobines enroulées α-hélicoïdales, qui dimérisent la molécule, suivies d’une région de queue globulaire pour la liaison de la cargaison. Sa cinétique reflète son implication dans le transport des mélanosomes dans les mélanocytes et du réticulum endoplasmique dans les neurones de Purkinje^16,17. M5a est considéré comme le prototype du moteur de transport de^{marchandises 18}.

Les myosines de classe 2, ou les myosines conventionnelles, comprennent les myosines qui alimentent la contraction des muscles squelettiques, cardiaques et lisses en plus des isoformes de myosine 2 (NM2) non musculaires, NM2a, 2b et 2c¹⁹. Les isoformes NM2 se trouvent dans le cytoplasme de toutes les cellules et ont des rôles partagés dans la cytocinèse, l’adhésion, la morphogenèse tissulaire et la migration cellulaire^19,20,21,22. Cet article traite des protocoles conventionnels de myosine dans le contexte de la myosine 2b (NM2b)^{non musculclée 23.} NM2b, par rapport à M5a, a un faible rapport de service et est enzymatiquement plus lent avec un V_max de 0,2 s^-123 par rapport au V_max de M5a de ≈18 s^-124. Notamment, les constructions NM2b tronquées avec deux têtes ne se déplacent pas facilement de manière processive sur l’actine; au contraire, chaque rencontre avec l’actine entraîne un coup de puissance suivi d’une dissociation de la molécule^25.

NM2b contient deux chaînes lourdes de myosine, chacune avec un domaine de tête globulaire, un bras de levier (avec un ELC et une chaîne légère régulatrice (RLC)), et un domaine de tige / queue enroulée α-hélicoïdale, d’environ 1 100 acides aminés de long, qui dimérise ces deux chaînes lourdes. L’activité enzymatique et l’état structurel du NM2b sont régulés par phosphorylation du RLC^23. Le NM2b non phosphorylé, en présence d’ATP et de forces ioniques physiologiques (environ 150 mM de sel), adopte une conformation compacte dans laquelle les deux têtes font participer à une interaction asymétrique et la queue se replie sur les têtes en deux endroits^23. Dans cet état, la myosine n’interagit pas fortement avec l’actine et a une très faible activité enzymatique. Lors de la phosphorylation RLC par la kinase à chaîne légère de la myosine dépendante de la calmoduline (MLCK) ou la protéine kinase associée à rho, la molécule s’étend et s’associe à d’autres myosines à travers la région de la queue pour former des filaments bipolaires d’environ 30 molécules de myosine²³. La phosphorylation susmentionnée du RLC entraîne également une augmentation de l’activité de l’ATPase activée par l’actine de NM2b d’environ quatre fois^26,27,28. Cet arrangement de filament bipolaire, avec de nombreux moteurs de myosine à chaque extrémité, est optimisé pour les rôles de contraction et de maintien de la tension, où les filaments d’actine avec des polarités opposées peuvent être déplacés les uns par rapport aux autres^23,29. En conséquence, il a été démontré que le NM2b agit comme un ensemble de moteurs lorsqu’il interagit avec l’actine. Le grand nombre de moteurs à l’intérieur de ce filament permet aux filaments NM2b de se déplacer de manière processive sur les filaments d’actine, ce qui rend la processivité du filament in vitro possible pour caractériser²⁹.

Bien que des progrès aient été réalisés dans la compréhension du rôle des myosines dans la cellule, il est nécessaire de comprendre leurs caractéristiques individuelles au niveau des protéines. Pour comprendre les interactions de l’actomyosine à un niveau d’interaction protéine-protéine simple, plutôt qu’à l’intérieur d’une cellule, nous pouvons exprimer et purifier les myosines recombinantes pour une utilisation dans des études in vitro. Les résultats de telles études informent ensuite les mécanobiologistes sur les propriétés biophysiques de myosines spécifiques qui conduisent finalement des processus cellulaires complexes^{12,13,14,25,29}. Typiquement, cela est accompli en ajoutant une étiquette d’affinité à une construction de myosine pleine longueur ou tronquée et en purifiant par chromatographie d’affinité^29,30,31. De plus, la construction peut être modifiée pour inclure un fluorophore génétiquement codé ou une étiquette pour le balisage des protéines avec un fluorophore synthétique. En ajoutant une telle étiquette fluorescente, des études d’imagerie à molécule unique peuvent être effectuées pour observer la mécanique et la cinétique de la myosine.

Après la purification, la myosine peut être caractérisée de plusieurs façons. L’activité de l’ATPase peut être mesurée par des méthodes colorimétriques, fournissant un aperçu de la consommation d’énergie globale et de l’affinité actine du moteur dans différentes conditions³². Pour en savoir plus sur la mécanochimie de sa motilité, d’autres expériences sont nécessaires. Cet article détaille deux méthodes basées sur la microscopie à fluorescence in vitro qui peuvent être utilisées pour caractériser les propriétés mobiles d’une protéine de myosine purifiée.

La première de ces méthodes est le test du filament d’actine planant, qui peut être utilisé pour étudier quantitativement les propriétés d’ensemble des moteurs de myosine, ainsi que pour étudier qualitativement la qualité d’un lot de protéine purifiée³³. Bien que cet article traite de l’utilisation de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) pour ce test, ces expériences peuvent être réalisées efficacement à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ équipé d’un appareil photo numérique, que l’on trouve couramment dans de nombreux laboratoires³⁴. Dans ce test, une couche saturante de moteurs à myosine est attachée à un couvercle. Cela peut être accompli en utilisant de la nitrocellulose, des anticorps, des membranes, des surfaces dérivatisées en_SiO2(telles que le triméthylchlorosilane), entre autres^{29,33,35,36,37,38}. Les filaments d’actine marqués par fluorescence sont passés à travers la chambre de couverture, sur laquelle l’actine se lie à la myosine attachée à la surface. Lors de l’ajout d’ATP (et de kinases dans l’étude de NM2), la chambre est imagée pour observer la translocation des filaments d’actine par les myosines liées à la surface. Un logiciel de suivi peut être utilisé pour corréler la vitesse et la longueur de chaque filament d’actine planant. Un logiciel d’analyse peut également fournir une mesure du nombre de filaments d’actine mobiles et stationnaires, ce qui peut être utile pour déterminer la qualité d’une préparation de myosine donnée. La proportion de filaments bloqués peut également être intentionnellement modulée par attache de surface de l’actine à d’autres protéines et mesurée pour déterminer la dépendance à la charge de la myosine^39. Étant donné que chaque filament d’actine peut être propulsé par un grand nombre de moteurs disponibles, ce test est très reproductible, la vitesse finale mesurée étant robuste aux perturbations telles que les altérations de la concentration de myosine de départ ou la présence de facteurs supplémentaires dans la solution. Cela signifie qu’il peut être facilement modifié pour étudier l’activité de la myosine dans différentes conditions, telles que la phosphorylation altérée, la température, la force ionique, la viscosité de la solution et les effets de la charge induite par les attaches de surface. Bien que des facteurs tels que les « têtes mortes » de myosine à forte liaison incapables d’hydrolyse de l’ATP puissent provoquer des filaments d’actine bloqués, de multiples méthodes existent pour atténuer ces problèmes et permettre des mesures précises. Les propriétés cinétiques de la myosine varient considérablement d’une classe à l’autre et, selon la myosine spécifique utilisée, la vitesse de glissement du filament d’actine dans ce test peut varier de moins de 20 nm / s (myosine^{9) 40,41}, et jusqu’à 60 000 nm / s (myosine characée 11)⁴².

Le second essai inverse la géométrie du test du filament d’actine glissant¹². Ici, les filaments d’actine sont attachés à la surface de couverture et le mouvement de molécules uniques de M5a ou de filaments bipolaires individuels de NM2b est visualisé. Ce test peut être utilisé pour quantifier les longueurs et les vitesses d’exécution de molécules ou de filaments de myosine simples sur l’actine. Un couvercle est recouvert d’un composé chimique qui bloque la liaison non spécifique et fonctionnalise simultanément la surface, tel que la biotine-polyéthylène glycol (biotine-PEG). L’ajout de dérivés d’avidine modifiés amorce ensuite la surface et l’actine biotinylée est passée à travers la chambre, ce qui donne une couche de F-actine liée de manière stable au fond de la chambre. Enfin, la myosine activée et étiquetée par fluorescence (généralement 1-100 nM) est acheminée à travers la chambre, qui est ensuite imagée pour observer le mouvement de la myosine sur les filaments d’actine stationnaires.

Ces modalités représentent des méthodes rapides et reproductibles qui peuvent être utilisées pour examiner la dynamique des myosines non musculaires et musculaires. Ce rapport décrit les procédures pour purifier et caractériser à la fois M5a et NM2b, représentant respectivement les myosines non conventionnelles et conventionnelles. Ceci est suivi d’une discussion de certaines des adaptations spécifiques à la myosine, qui peuvent être effectuées pour obtenir une capture réussie du mouvement dans les deux types de test.

Expression et biologie moléculaire
L’ADNc de la myosine d’intérêt doit être cloné sur un vecteur pFastBac1 modifié qui code soit pour une balise FLAG terminale C (DYKDDDDK) si elle exprime M5a-HMM, soit pour une balise FLAG N-terminale si elle exprime la molécule pleine longueur de NM2b^{23,43,44,45,46}. Les marqueurs FLAG C-terminal sur NM2b entraînent une affinité affaiblie de la protéine pour la colonne d’affinité FLAG. En revanche, la protéine marquée N-terminally FLAG se lie généralement bien à la colonne d’affinité FLAG²³. La protéine marquée N-terminale conserve l’activité enzymatique, l’activité mécanique et la régulation dépendante de la phosphorylation²³.

Dans cet article, une construction de type M5a de type Mromyosine lourde (HMM) de souris tronquée avec un GFP entre l’étiquette FLAG et le terminus C de la chaîne lourde de myosine a été utilisée. Notez que contrairement à NM2b, M5a-HMM peut être étiqueté et purifié avec succès avec des balises FLAG N ou C-terminal et dans les deux cas, la construction résultante sera active. La chaîne lourde M5a a été tronquée à l’acide aminé 1090 et contient un tritrateur d’acides aminés (GCG) entre le GFP et la région de la bobine enroulée du M5a^47. Aucun éditeur de liens supplémentaire n’a été ajouté entre le GFP et la balise FLAG. M5a-HMM a été co-exprimé avec la calmoduline. La construction NM2b humaine pleine longueur a été co-exprimée avec ELC et RLC. Le N-termini du RLC a été fusionné avec un GFP via un linker de cinq acides aminés (SGLRS). Directement attaché à la balise FLAG était un HaloTag. Entre le HaloTag et le N-terminus de la chaîne lourde de la myosine se trouvait un linker composé de deux acides aminés (AS).

Les deux préparations de myosine ont été purifiées à partir d’un litre de culture cellulaire Sf9 infectée par le baculovirus à une densité d’environ 2 x 10⁶ cellules / mL. Les volumes du baculovirus pour chaque sous-unité dépendaient de la multiplicité d’infection du virus telle que déterminée par les instructions du fabricant. Dans le cas de M5a, les cellules ont été co-infectées par deux baculovirus différents, l’un pour la calmoduline et l’autre pour la chaîne lourde M5a. Dans le cas du NM2b, les cellules ont été co-infectées par trois virus différents: un pour ELC, un pour RLC et un pour nm2b chaîne lourde. Pour les laboratoires travaillant avec une diversité de myosines (ou d’autres protéines multi-complexes), cette approche est efficace car elle permet de nombreuses combinaisons de chaînes lourdes et légères et les chaînes légères couramment utilisées telles que la calmoduline peuvent être co-transfectées avec de nombreuses chaînes lourdes de myosine différentes. Tous les travaux cellulaires ont été effectués dans une armoire de biosécurité avec une technique stérile appropriée pour éviter la contamination.

Pour l’expression de M5a et NM2b, les cellules Sf9 produisant les myosines recombinantes ont été collectées 2 à 3 jours après l’infection, par centrifugation, et stockées à -80 °C. Les pastilles cellulaires ont été obtenues en centrifugant les cellules Sf9 co-infectées à 4 °C pendant 30 min à 2 800 x g. Le processus de purification des protéines est détaillé ci-dessous.