Cellfraktionering av U937-celler genom isopycnic density gradient reification

Subcellulär fraktionering är ett förfarande där celler lyseras och separeras i sina beståndsdelar genom flera metoder. Denna teknik kan användas av forskare för att bestämma proteinlokalisering i däggdjursceller eller för anrikning av proteiner med låg förekomst som annars inte skulle kunna upptäckas. Även om det för närvarande finns metoder för subcellulär fraktionering, liksom kommersiella kit som kan köpas, lider de av flera begränsningar som denna procedur försöker övervinna. De flesta cellfraktioneringsmetoder är uteslutande tvättmedelsbaserade^1,2, beroende av användning av buffertar som innehåller ökande mängder tvättmedel för att solubilisera olika cellulära komponenter. Även om denna metod är snabb och bekväm, resulterar den i orena fraktioner. Dessa är utformade för att göra det möjligt för forskare att enkelt isolera en eller två komponenter i cellen, men är inte tillräckligt komplexa för att isolera flera subcellulära fraktioner från ett prov samtidigt. Att enbart förlita sig på tvättmedel resulterar vanligtvis i membranslutna organeller och plasmamembranet som urskillningslöst lösgörs, vilket gör separationen av dessa komponenter svår. En ytterligare komplikation från användningen av dessa kit är forskarnas oförmåga att ändra / optimera dem för specifika applikationer, eftersom de flesta komponenterna är proprietära formuleringar. Slutligen kan dessa kit vara oöverkomligt dyra, med begränsningar i antalet användningsområden som gör dem mindre än idealiska för större prover.

Trots tillgången på kit för isolering av mitokondrier som inte är beroende av tvättmedel är de inte utformade för att isolera plasmamembranet och ge betydligt lägre mängder prov än standardisoleringsprotokoll ^3,4. Även om differentialcentrifugeringsmetoder är mer tidskrävande, resulterar de ofta i distinkta fraktioner som inte kan erhållas med uteslutande tvättmedelsbaserade kit¹. Separation utan enbart användning av solubiliserande tvättmedel möjliggör också ytterligare rening med ultracentrifugering och isopycnic densitetsgradienter, vilket resulterar i mindre korskontaminering. Detta fraktioneringsprotokoll visar isoleringen av subcellulära fraktioner från U937-monocyter med användning av en kombination av tvättmedels- och höghastighetscentrifugeringsbaserade metoder. Denna metod kommer att underlätta isoleringen av kärn-, cytoplasmatiska, mitokondriella och plasmamembrankomponenterna i en däggdjurscell med minimal förorening mellan fraktionerna.