Cellefraktionering af U937-celler ved isopycnic densitetsgradientrensning

Subcellulær fraktionering er en procedure, hvor celler lyseres og adskilles i deres bestanddele gennem flere metoder. Denne teknik kan bruges af forskere til at bestemme proteinlokalisering i pattedyrceller eller til berigelse af proteiner med lav forekomst, som ellers ikke ville kunne detekteres. Mens der i øjeblikket findes metoder til subcellulær fraktionering, ligesom kommercielle kits, der kan købes, lider de af flere begrænsninger, som denne procedure forsøger at overvinde. De fleste cellefraktioneringsmetoder er udelukkende vaskemiddelbaserede^1,2, der er afhængige af brugen af buffere^, der indeholder stigende mængder vaskemiddel til at opløse forskellige cellulære komponenter. Selvom denne metode er hurtig og praktisk, resulterer den i urene fraktioner. Disse er designet til at give forskere mulighed for let at isolere en eller to komponenter i cellen, men er ikke komplekse nok til at isolere flere subcellulære fraktioner fra en prøve på samme tid. At stole udelukkende på vaskemidler resulterer normalt i membranlukkede organeller, og plasmamembranen opløses vilkårligt, hvilket gør adskillelse af disse komponenter vanskelig. En yderligere komplikation fra brugen af disse kits er forskernes manglende evne til at ændre / optimere dem til specifikke applikationer, da de fleste af komponenterne er proprietære formuleringer. Endelig kan disse sæt være uoverkommeligt dyre med begrænsninger i antallet af anvendelser, der gør dem mindre end ideelle til større prøver.

På trods af tilgængeligheden af sæt til isolering af mitokondrier, der ikke er afhængige af vaskemidler, er de ikke designet til at isolere plasmamembranen og give betydeligt lavere mængder prøve end standardisoleringsprotokoller ^3,4. Mens differentielle centrifugeringsmetoder er mere tidskrævende, resulterer de ofte i forskellige fraktioner, der ikke kan opnås med udelukkende vaskemiddelbaserede sæt¹. Separation uden udelukkende brug af opløselige vaskemidler tillader også yderligere rensning ved hjælp af ultracentrifugering og isopycniske densitetsgradienter, hvilket resulterer i mindre krydskontaminering. Denne fraktioneringsprotokol demonstrerer isolering af subcellulære fraktioner fra U937-monocytter ved hjælp af en kombination af vaskemiddel- og højhastighedscentrifugeringsbaserede tilgange. Denne metode vil lette isoleringen af de nukleare, cytoplasmatiske, mitokondrielle og plasmamembrankomponenter i en pattedyrcelle med minimal forurening mellem fraktionerne.