Detta fraktioneringsprotokoll gör det möjligt för forskare att isolera cytoplasmatiska, nukleära, mitokondriella och membranproteiner från däggdjursceller. De två senare subcellulära fraktionerna renas ytterligare via isopycnic densitetsgradient.
Detta protokoll beskriver en metod för att erhålla subcellulära proteinfraktioner från däggdjursceller med användning av en kombination av tvättmedel, mekanisk lys och isopycnic densitetsgradientcentrifugering. Den största fördelen med denna procedur är att den inte är beroende av den enda användningen av solubiliserande tvättmedel för att erhålla subcellulära fraktioner. Detta gör det möjligt att separera plasmamembranet från andra membranbundna organeller i cellen. Denna procedur kommer att underlätta bestämningen av proteinlokalisering i celler med en reproducerbar, skalbar och selektiv metod. Denna metod har framgångsrikt använts för att isolera cytosoliska, nukleära, mitokondriella och plasmamembranproteiner från den humana monocytcellinjen, U937. Även om den är optimerad för denna cellinje kan denna procedur fungera som en lämplig utgångspunkt för subcellulär fraktionering av andra cellinjer. Potentiella fallgropar i förfarandet och hur man undviker dem diskuteras liksom förändringar som kan behöva övervägas för andra cellinjer.
Subcellulär fraktionering är ett förfarande där celler lyseras och separeras i sina beståndsdelar genom flera metoder. Denna teknik kan användas av forskare för att bestämma proteinlokalisering i däggdjursceller eller för anrikning av proteiner med låg förekomst som annars inte skulle kunna upptäckas. Även om det för närvarande finns metoder för subcellulär fraktionering, liksom kommersiella kit som kan köpas, lider de av flera begränsningar som denna procedur försöker övervinna. De flesta cellfraktioneringsmetoder är uteslutande tvättmedelsbaserade1,2, beroende av användning av buffertar som innehåller ökande mängder tvättmedel för att solubilisera olika cellulära komponenter. Även om denna metod är snabb och bekväm, resulterar den i orena fraktioner. Dessa är utformade för att göra det möjligt för forskare att enkelt isolera en eller två komponenter i cellen, men är inte tillräckligt komplexa för att isolera flera subcellulära fraktioner från ett prov samtidigt. Att enbart förlita sig på tvättmedel resulterar vanligtvis i membranslutna organeller och plasmamembranet som urskillningslöst lösgörs, vilket gör separationen av dessa komponenter svår. En ytterligare komplikation från användningen av dessa kit är forskarnas oförmåga att ändra / optimera dem för specifika applikationer, eftersom de flesta komponenterna är proprietära formuleringar. Slutligen kan dessa kit vara oöverkomligt dyra, med begränsningar i antalet användningsområden som gör dem mindre än idealiska för större prover.
Trots tillgången på kit för isolering av mitokondrier som inte är beroende av tvättmedel är de inte utformade för att isolera plasmamembranet och ge betydligt lägre mängder prov än standardisoleringsprotokoll 3,4. Även om differentialcentrifugeringsmetoder är mer tidskrävande, resulterar de ofta i distinkta fraktioner som inte kan erhållas med uteslutande tvättmedelsbaserade kit1. Separation utan enbart användning av solubiliserande tvättmedel möjliggör också ytterligare rening med ultracentrifugering och isopycnic densitetsgradienter, vilket resulterar i mindre korskontaminering. Detta fraktioneringsprotokoll visar isoleringen av subcellulära fraktioner från U937-monocyter med användning av en kombination av tvättmedels- och höghastighetscentrifugeringsbaserade metoder. Denna metod kommer att underlätta isoleringen av kärn-, cytoplasmatiska, mitokondriella och plasmamembrankomponenterna i en däggdjurscell med minimal förorening mellan fraktionerna.
Denna metod är en modifierad version av ett tidigare publicerat tillvägagångssätt för subcellulär fraktionering utan användning av höghastighetscentrifugering11. Denna modifierade metod kräver mer specialutrustning för att uppnå bästa resultat, men är mer omfattande och konsekvent reproducerbar.
Utvecklingen av det ursprungliga protokollet var nödvändigt på grund av en oförmåga att separera mitokondriella och membranprover för analys av proteinlokalis…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH R15-HL135675-01 och NIH 2 R15-HL135675-02 till T.J.L.
Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | 61-BB50-DX | |
digitonin | Sigma | D141 | |
end-over-end rotator | ThermoFisher | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E9884 | |
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | |
GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
HEPES | VWR | 97064-360 | |
Hexylene glycol | Sigma | 68340 | |
Igepal | Sigma | I7771 | Non-ionic, non-denaturing detergent |
KCl | Sigma | P9333 | |
Mannitol | Sigma | M9647 | |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
NaCl | Sigma | S9888 | |
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium | Sigma | D1556-250ML | |
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | |
refrigerated centrifuge | ThermoFisher | ||
S50-ST Swinging Bucket Rotor | Eppendorf | ||
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | 436143 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
sodium orthovanadate (SOV) | Sigma | 567540 | |
sonicator | ThermoFisher | ||
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher | ||
Stainless Steel Beads 3.2 mm | Next Advance | SSB32 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 97062-370 | |
Tween 20 | non-ionic detergent in western blotting buffers | ||
VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |