클릭 화학을 이용한 지방 아실화 단백질의 검출을 위한 알키닐 지방산 유사체의 최적화된 혼입

1. 세포 배양 세포 배양을 위해 DMEM(둘베코 변형 이글 배지)을 보충하려면 10% 태아 소 혈청(FBS), 1x 페니실린-스트렙토마이신, 2mM L-글루타민 및 100mM 소듐 피루베이트(1% vol/vol)를 추가합니다. 6-웰 조직 배양 접시의 약 5 x 105 HEK293T 세포/웰을 플레이트하고, 5% CO2가 있는 37°C 가습 인큐베이터에서 18시간 동안 성장시켜 75%-80% 컨플루언시에 도달한다. 지방산 혈청 박탈 라벨링 배지를 준비하려면 10% FBS가 없는 위와 같이 DMEM(단계 1.1)을 준비합니다. FBS를 5% 덱스트란 숯 코팅 FBS(DCC-FBS)로 교체합니다. 사용 전에 37°C로 미리 예온합니다. 세포를 실온에서 1x 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 부드럽게 세척하고 표지 배지로 교체한다.참고: HEK293T 세포는 조직 배양 플레이트에서 쉽게 분리됩니다. 세포를 세척하고 배지를 교체 할 때주의하십시오. 가능한 한 인큐베이터를 오가는 동안 교반을 최소화하십시오. 세포를 5% CO2 로 37°C 인큐베이터로 되돌리고, 지방산으로 대사 표지를 진행하기 전에 약 45분(최소 15분이 효과적임)까지 60분 동안 배양한다. 2. 지방산 유사체의 제조 및 비누화 알키닐 지방산의 스톡 용액을 DMSO에 가용화하여 미리 준비하여 다음과 같은 농도를 달성하고 -20°C에서 저장한다. 필요에 따라 실온에서 해동하십시오. 최상의 성능을 위해 준비물을 N2 또는 Ar에 보관하십시오.알키닐-미리스테이트 (13-테트라데시노산, 13-TDYA): 25 mM알키닐팔미테이트(15-헥사데시노산; 15-HDYA): 100 mM알키닐-스테아레이트 (17-옥타데시노산; 17-ODYA): 100 mM 20% 무지방산 BSA(FAFBSA)를 제조하기 위해, 50 mL 일회용 튜브에 FAFBSA 2 g을 칭량한다. 미리 가온된(37°C) DMEM으로 최대 10mL를 가져온다. 엔드-오버-엔드 회전에 의해 또는 볼텍싱에 의해 혼합하고, FAFBSA를 완전히 용해시키기 위해 37°C 수조에 놓는다. 0.2 μm 필터를 사용하여 배지를 여과하십시오. 분취량을 대략 1 mL 부피로 -20°C에서 저장한다. 필요에 따라 해동하고 사용 전에 수조에서 37°C로 따뜻하게 한다. 지방산 및 지방산 유사체의 용해도를 강화시키기 위해, 3 mL 유리 원뿔형 반응 바이알에서 20% 몰 과량의 수산화칼륨(KOH)과 함께 인큐베이션함으로써 비누화시킨다.참고: 이 바이알은 FAFBSA가 고열로부터 응고되지 않도록 하면서 염이 용해성을 유지할 수 있도록 합니다. 유리를 사용하면 지방산이 플라스틱에 달라 붙는 것을 방지 할 수 있습니다. 적어도 2 μL의 알키닐 지방산 유사체를 3 mL 원뿔형 반응 바이알의 바닥에 직접 피펫팅한다. 사용된 6-웰 플레이트의 웰당 2 μL의 지질을 준비한다( 표 1 참조).참고 : 지방산의 소수성으로 인해 반응 바이알에 분배하기 전에 원하는 부피를 여러 번 그려서 피펫의 끝을 코팅하는 것이 가장 좋습니다. 1 M KOH를 20% 몰 과량의 알키닐 지방산 라벨 (13-TDYA의 경우 30 mM, 15-HDYA 및 17-ODYA의 경우 120 mM)과 동일한 농도로 희석한다. 동량의 희석된 KOH (1 μL:1 μL 지방산:KOH)를 유리의 가장자리에 있는 반응 바이알의 바닥에 가깝게 피펫 아웃하고, KOH의 분배된 부피가 지방산과 혼합되도록 한다. 바이알의 뚜껑을 닫고 부드럽게 탭하여 용액을 혼합하십시오.참고: 혼합물은 특히 지방산의 탄화수소 사슬의 길이가 증가함에 따라 빠르게 응고될 수 있습니다. 고체를 피펫팅하지 않도록주의하십시오 (즉, 피펫팅으로 혼합하지 마십시오). 반응 바이알을 65°C에서 약 5분 동안 가열하거나, 지방산이 혼입되자마자 가열한다(용액이 맑아진다).참고: 스테아레이트(17-ODYA)와 같이 탄소 수가 많고 용해도가 감소된 지방산은 65°C에서 KOH에 완전히 혼입되기 위해 더 긴 인큐베이션 시간이 필요할 수 있습니다. 필요한 경우 온도를 70 °C로 올립니다. 수조가 가장 좋습니다. 액체가 너무 많이 증발하지 않도록주의하십시오. 일단 지방산이 용액으로 들어가고 가시적인 고체가 남아 있지 않으면, 피펫은 지방산의 부피비가 1:1:50이 되도록 20% FAFBSA를 예열하여 BSA 결합 알키닐 지방산의 최종 농도 20x를 달성하였다. 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오. 용액은 일반적으로 눈에 보이는 고체가 없는 선명하게 보입니다.참고: 전형적으로, 임의의 작은 고체는 37°C에서 인큐베이션 후에 용액으로 들어갈 것이다. 지방산 및 FAFBSA를 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.참고: 이 시점에서 비누화 라벨은 15분 이상 안정적입니다.   총 매체 부피(mL) Vol. 지방산 또는 지방산 유사체 (μL) 권. KOH (μL) Vol. 20% FAFBSA (μL) BSA 컨쥬게이션 비누화 라벨(μL)의 총 vol. 4 4 4 200 208 2 2 2 100 104 표 1: 비누화 지방산 표지 비율. 사용된 배지의 부피에 따른 지방산 라벨의 비누화를 위한 지방산, KOH, 및 FAFBSA의 실험적 부피. 컨트롤로 2.3단계를 반복합니다. 알킨 라벨이없는 지방산. 세포를 20x 지방산-BSA 접합체의 1/20 부피로 기아 배지 (전형적으로, 2 mL 배지/세포에서 100 μL)에 직접 라벨링하여 알키닐-미리스테이트의 경우 1% BSA 및 25 μM의 최종 농도를 달성하고, 알키닐-팔미테이트 및 알키닐-스테아레이트의 경우 100 μM을 달성한다.참고: 부착된 세포에 대한 물리적 교란의 양을 최소화하려면 피펫 끝에 배지에 직접 피펫팅하는 대신 피펫 표면에 가까운 물방울을 형성하십시오. 아실화 억제제를 사용하는 경우, 표지된 지방산에 적어도 15분 전에 첨가한다. 시간은 사용되는 세포 또는 억제제에 따라 달라질 수 있다. 이 단계에서도 비누화를 사용하는 것이 좋습니다28. 비교를 위해, 표지되지 않은 지방산의 2 μL (또는 사폰화된 부피와 동등한)를 기아 배지에 직접 피펫팅함으로써 비누화되지 않은 지질을 첨가한다. 세포를 다시 배양기에 넣고 3-6 시간 동안 배양하십시오.참고: 최적의 라벨링 타이밍은 각 세포 유형 또는 실험 조건에 대해 결정되어야 할 수도 있습니다. 더 긴 인큐베이션 시간은 잠재적으로 β산화 및/또는 인지질28과 같은 다른 지질 그룹으로의 혼입에 의한 지방산의 분해로 이어질 수 있다. 세포를 실온에서 1x PBS로 부드럽게 세척한다. 세포를 500 μL 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 무함유 변형 방사선면역침전 검정 (RIPA) 완충액 (0.1% SDS, 50 mM N-2-히드록시에틸피페라진-N-에탄술폰산 (HEPES) pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% 비변성 세제, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 2 mM MgCl2 와 갓 첨가된 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF), 및 10 μg/μL 펩스타틴 A (또는 EDTA-프리 완전 프로테아제 억제제 칵테일)로 세포를 수확하고 용해시켜 용해물을 4°C에서 15분 동안 흔들었다. 용해물을 4°C에서 10분 동안 16,000 x g 에서 원심분리한다. 상층액을 1.7 mL 마이크로 원심분리 튜브에 수집하고, 클릭 반응을 진행할 준비가 될 때까지 -20°C에서 보관한다.참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 용해물은 -20°C에서 최대 1개월 동안 안정하다. 그러나 적시에 클릭 반응을 진행하는 것이 좋습니다. 세제 상용성(DC) 분석과 같은 제조자의 프로토콜에 따라 적절한 검정을 사용하여 단백질 농도를 정량화한다. 3. 세포 용해물에 대한 클릭 반응 클릭 화학을 위해 시약을 준비하십시오. 트리스-(벤질트리아졸릴메틸)아민(TBTA)을 DMSO에 2 mM로 용해시킨다. 건조제와 함께 작은 분취량을 -20 °C에서 최대 2-3 개월 동안 보관하십시오. N2 또는 Ar 아래에 저장되는 것이 가장 좋습니다. CuSO4를 ddH2O 물에 녹여 50mM을 달성하십시오. 실온에서 최대 2 개월 동안 보관하십시오. 트리스카르복시에틸포스핀(TCEP)을 ddH2O 물에 250 mM로 용해시킨다. 4°C의 어둠 속에 보관하고 클릭 반응 직전에 신선한 50mM 희석액을 만듭니다. DMSO에서 2 mM 아지드를 준비한다. 건조제와 함께 작은 분취량을 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. N2 또는 Ar 아래에 저장되는 것이 가장 좋습니다.참고 : 세 개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 그룹을 가진 제품이 비오틴과 가장 잘 작동한다는 것이 관찰되었습니다. 50-100 μg의 단백질 용해물을 1.7 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣고 위와 동일한 용해 완충액을 사용하여 동일한 부피로 옮긴다.참고: 반응 부피를 가능한 한 작게 유지하십시오 (20-100 μL). 각 샘플에 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 첨가하여 최종 1% 농도를 달성한다. 용해물에 첨가된 후 최종 농도가 100 μM TBTA (2 mM 스톡), 1 mM CuSO4, (50 mM 스톡) 1 mM TCEP (50 mM 스톡), 및 100 μM 아지드 프로브 (2 mM 스톡)가 되도록 클릭 시약의 마스터 믹스를 준비한다. 그에 따라 스톡 솔루션을 결합하십시오(표 2 참조).참고: 순서는 중요합니다. 각 성분을 첨가 한 후 완전히 혼합하십시오. 용해물에 적절한 양의 마스터 믹스를 추가하십시오. 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오. 37°C 수조에서 어둠 속에서 30분 동안 인큐베이션한다. 때때로 동요 / 혼합. 총 반응 vol (μL) Vol. 단백질 (μL) Vol. TBTA (2 mM) (μL) 전압. CuSO4 (50 mM) (μL) 권. TCEP (50 mM) (μL) Vol. 아지도 프로브 (2 mM) (μL) 50 43 2.5 1 1 2.5 100 86 5 2 2 5 표 2: 시약 및 단백질 부피비를 클릭합니다. 클릭 화학 시약의 실험 부피 및 상응하는 스톡 농도, 단백질 샘플의 부피 이외에. 4. 면역침전 단백질에 대한 클릭 반응 대안적으로, 비드 위 또는 오프 면역침전 (IP) 단백질 에 대한 클릭 반응을 수행할 수 있다.참고: 일반적으로 비드 를 클릭하는 것은 배경이 가장 적고 관심있는 새로운 단백질을 테스트 할 때 가장 좋습니다. 관심있는 단백질에 대해 트랜스펙션된 세포는, 이 경우, 야생형 미리스토일화 C-말단 헌팅틴(HTT)이 G2A 치환과 함께 GFP(myr-ctHTT-GFP) 및 ctHTT-GFP에 융합되고, 앞서 기술된 바와 같이 인산칼슘 DNA 공침전을 사용하여41. 플레이트 2.5 x 105 세포/웰을 6-웰 조직 배양 플레이트에 넣고 하룻밤 동안 ~70-80% 컨플루언시까지 성장시킨다. 1.7 mL 마이크로원심분리 튜브에 99.75 μL 분자 등급 H2O와 함께 10 μL의 DNA 2.5 μg을 첨가하여 DNA 믹스를 제조하였다. 이어서, CaCl2 15.25 μL를 DNA 믹스에 적가한다. DNA/CaCl2 혼합물을 125 μL 2x HEPES 완충 식염수(HBS, pH 7.0)가 들어있는 별도의 튜브에 혼합하면서 적가하여 첨가한다. DNA/CaCl2/HBS 믹스를 세포에 천천히 첨가하십시오. 2-4 시간 후, 배지를 교체하고 밤새 인큐베이션하십시오. 1.3-2.8단계부터 레이블링을 진행합니다. 용해 완충액에 동일한 부피의 500 μg 단백질을 준비하십시오. 4°C에서 밤새 회전하는 ctHTT-GFP에 대해 토끼 항-GFP와 함께 인큐베이션함으로써 IP를 수행한다. 용해 완충액으로 미리 평형화된 15-20 μL 단백질 G 비드를 각 튜브에 첨가하고, 4°C에서 3시간 동안 엔드-오버 엔드-엔드-엔드-오버-엔드-오버-엔드-엔드-오버-엔드-엔드 비드를 용해 완충액으로 세척하고 45 μL 1% SDS 50 mM HEPES 완충액에 재현탁시켰다. 비드를 80°C에서 15분 동안 가열하고 튜브를 반전시키거나 대략 5분마다 교반한다. 튜브를 잠깐 회전시키고 80°C로 복귀시킨다. 샘플이 여전히 따뜻할 때 단백질을 포함하는 상청액을 수집하십시오.참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 클릭 화학에 즉시 사용하지 않을 경우 면역침전된 샘플을 -20°C 또는 -80°C에서 저장할 수 있습니다. 43 μL의 상청액이 클릭 시약의 7 μL 마스터 믹스와 반응하도록 허용한다. 단계 3.2.3에 명시된 바와 같이 반응을 진행한다. 5. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 반응을 중지시키고 25 mM 디티오트레이톨(DTT)을 함유하는 1x 샘플 로딩 버퍼를 첨가하고 95°C에서 5분 동안 가열함으로써 변성시킨다.참고: 최대 100mM DTT를 사용할 수 있습니다28. 티오에스테르 결합을 가수분해하고 클릭된 지방산 유사체를 제거할 수 있으므로 β-메르캅토에탄올을 S-아실화 단백질과 함께 사용하지 마십시오. 샘플을 간단히 스핀다운합니다. 폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE로 단백질을 중복하여 분리한다.참고 : 티오에스테르 결합의 존재를 확인하기 위해 KOH로 알칼리성 처리를 위해 두 개의 젤이 필요합니다. 형광 아지드 프로브를 사용하는 경우, 아실화는 지시된 여기 채널을 사용하여 겔 내 또는 전사 후에 검출될 수 있다. 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 멤브레인 (메탄올에서 활성화되고 ddH2O에서 헹구어 – 각각 5 분)으로 25V, 1.0 A (상수)에서 30 분 동안 반건조 전달 장치로 옮깁니다. ddH2O로 멤브레인을 간단히 헹구어 낸 후, 한 복제 멤브레인을 메탄올 / 물 (9:1 v / v)의 0.1 M KOH (9 : 1 v / v)에 담그고 다른 하나는 메탄올 / 물 (9 : 1 v / v)의 0.1 M Tris-HCl pH 7.0에 담가 비알칼리성 대조군으로 실온에서 60 분 동안 부드럽게 흔들어 놓습니다. 멤브레인을 ddH2O 물에서 간단히 헹구고, PBS-T (1x PBS, 0.1% 트윈 20)로 5분간 6회 세척하였다.참고: 철저히 씻으십시오. 멤브레인을 5% 탈지유 차단 완충액(1x PBS, 0.1% Tween20)에서 하룻밤 동안 차단한다. 6. 웨스턴 블롯 수행 지시된 경우, 형광 태그가 붙은 스트렙타비딘 (1:5000) 및 로딩 대조군, 항-GAPDH 로다민 (1:5000)을 5% BSA 차단 완충액 (0.01% SDS, 1x PBS, 0.1% Tween20)으로 실온에서 45-60분 동안 어둠 속에서 부드럽게 흔들면서 프로브. 면역침전된 단백질 블롯을 먼저 5% 탈지유 차단 완충액 중의 일차 항-GFP 항체로 조사한 다음, 단계 6.1에서와 같이 5% BSA에서 적절한 이차 항체로 프로브한다. 멤브레인을 PBS-T (1x PBS, 0.1% Tween20)로 5분 동안 세척하고 총 네 번의 반복으로 영상화하기 전에 ddH2O 물로 헹구었다.