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Bioquímica

Incorporation optimisée d’analogues d’acides gras alcynyles pour la détection de protéines acylées grasses à l’aide de la chimie du clic

Published: April 09, 2021
doi:
10.3791/62107
, ,
1Department of Biology,University of Waterloo

Summary

L’étude de l’acylation graisseuse a des implications importantes dans les interactions et les maladies des protéines cellulaires. Présenté ici est un protocole modifié pour améliorer la détection chimique du clic des protéines acylées grasses, qui peut être appliqué dans divers types de cellules et combiné avec d’autres tests, y compris la chasse au pouls et la spectrométrie de masse.

Abstract

L’acylation graisseuse, l’ajout covalent d’acides gras saturés aux substrats protéiques, est importante dans la régulation d’une myriade de fonctions cellulaires en plus de ses implications dans le cancer et les maladies neurodégénératives. Les développements récents dans les méthodes de détection de l’acylation grasse ont permis une détection efficace et non dangereuse des protéines acylées grasses, en particulier grâce à l’utilisation de la chimie du clic avec marquage bio-orthogonal. Cependant, la détection de la chimie du clic peut être limitée par la faible solubilité et les effets toxiques potentiels de l’ajout d’acides gras à longue chaîne à la culture cellulaire. Décrit ici est une approche d’étiquetage avec une livraison optimisée en utilisant des acides gras saponifiés en combinaison avec de la BSA sans acide gras, ainsi que des milieux délipidés, ce qui peut améliorer la détection des protéines acylées grasses difficiles à détecter. Cet effet a été le plus prononcé avec l’analogue alcynyl-stéarate, 17-ODYA, qui a été l’analogue d’acide gras le plus couramment utilisé dans la détection chimique du clic des protéines acylées. Cette modification améliorera l’incorporation cellulaire et augmentera la sensibilité à la détection des protéines acylées. En outre, cette approche peut être appliquée à une variété de types de cellules et combinée à d’autres tests tels que l’analyse de chasse au pouls, le marquage d’isotopes stables avec des acides aminés en culture cellulaire et la spectrométrie de masse pour le profilage quantitatif des protéines acylées grasses.

Introduction

L’acylation graisseuse implique l’ajout covalent d’acides gras aux protéines et est bien connue pour son importance dans la promotion des interactions protéine-membrane, mais il a également été démontré qu’elle favorise les interactions protéine-protéine, les changements conformationnels et régule les sites catalytiques des enzymes1,2,3,4,5,6,7 . L’acylation graisseuse est apparue comme une cible médicamenteuse potentielle dans une myriade de maladies, y compris l’infection, le cancer, l’inflammation et la neurodégénérescence, où des perturbations de la palmitoylation ont été documentées8,9,10,11,12,13. Cela a été principalement stimulé par le développement de nouvelles méthodes de détection chimique, qui ont permis l’identification à grande échelle de cibles protéiques S-acylées.

L’acylation graisseuse peut inclure une variété de modifications impliquant l’ajout covalent d’acides gras saturés et insaturés, mais se réfère généralement à la N-myristoylation et à la S-acylation. La N-myristoylation fait référence à l’ajout d’acide myristique aux glycines N-terminales soit de manière co-traductionnelle sur les polypeptides naissants, soit post-traductionnelle sur les glycines N-terminales nouvellement exposées après clivage protéolytique2,14. La N-myristoylation se produit par une liaison amide irréversible. D’autre part, l’acylation S se réfère généralement à l’ajout réversible d’acides gras à longue chaîne aux résidus de cystéine via une liaison thioester. La forme la plus courante de cette modification comprend l’incorporation de palmitate et, par conséquent, est communément appelée S-palmitoylation, ou simplement palmitoylation11,15. À bien des égards, la S-palmitoylation est similaire à la phosphorylation. Il est dynamique, régulé enzymatiquement et s’avère très facile à gérer.

Jusqu’à la dernière décennie, l’étude de l’acylation des graisses était entravée par des méthodes de détection limitées, qui nécessitaient des acides gras marqués radioactivement. Cela présentait plusieurs inconvénients, notamment le coût, les problèmes de sécurité et les temps de détection très longs. En règle générale, le palmitate tritié ou iodé a été utilisé pour la détection de l’acylation S16. Le palmitate tritié nécessitait de longues périodes de détection avec un film d’autoradiographie, ce qui peut prendre des semaines à des mois. Bien que les analogues des acides gras iodo [125I] raccourcissent les temps de détection, ils présentent un risque beaucoup plus élevé pour l’innocuité et nécessitent une surveillance étroite de la thyroïde des expérimentateurs. En outre, ces méthodes étaient non quantitatives, limitant donc la capacité de mesurer la palmitoylation dynamique, et prenant également beaucoup de temps à mettre en place et à nettoyer en raison de l’équipement de protection individuelle supplémentaire et de la surveillance radioactive. Enfin, les étiquettes radioactives n’étaient pas bien adaptées aux études protéomiques et se limitaient généralement à la détection à faible débit de protéines spécifiques d’intérêt. Au fur et à mesure que davantage de substrats ont été détectés et, inévitablement, les enzymes qui interviennent dans chaque modification ont été identifiées, il était clair que de nouvelles méthodes de détection étaient nécessaires17,18,19,20,21. Presque simultanément, plusieurs nouvelles méthodes sont apparues pour la détection des protéines acylées grasses. Le premier exploite la réversibilité et la réactivité de la liaison thioester de la S-acylation. Le test d’échange acyl-biotine (ABE) remplace chimiquement le palmitate par de la biotine pour l’extraction ultérieure des protéines S-acylées à l’aide de billes d’agarose d’avidine et la détection directe par transfert western22,23,24. Ensuite, le marquage bio-orthogonal des acides gras et l’ajout chimiosélectif aux étiquettes ou aux poignées ont été développés, y compris l’utilisation de la ligature de Staudinger et de la chimie du clic25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Enfin, à l’instar de l’ABE, la capture assistée par résine d’acyle (RAC) remplace essentiellement les sites S-acylés par des billes thiol-réactives pour la capture et la détection des protéines S-acylées34,35. Ensemble, les essais basés sur l’échange et la chimie du clic ont fourni des méthodes plus efficaces et plus sensibles de détection de l’acylation et de purification de l’affinité pour l’analyse en aval et ont ensuite conduit à la découverte de milliers de protéines S-acylées8,36.

Le terme chimie du clic englobe un groupe de réactions chimiques, mais se réfère le plus souvent au mécanisme de réaction de cycloaddition azido-alcyne catalysé par Cu(I) [3+2] entre un groupe alcynyle et un groupe azido27,28,37. En particulier, dans le cas de l’acylation graisseuse, la chimie du clic implique la détection de la S-palmitoylation ou de la N-myristylation en incorporant respectivement de l’alcynyl-palmitate bio-orthogonal de 16 carbone (acide 15-hexadécynoïque; 15-HDYA) ou le myristate d’alcynyle de 14 carbones (acide 13-tétradécynoloïque; 13-TDYA), dans les cellules pour marquer les protéines acylées de manière endogène28 . Après la lyse cellulaire et l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt, une réaction chimique du clic (liaison covalente entre un alcyne et un azoture) est effectuée pour lier une sonde d’affinité, typiquement la biotine, pour la détection par transfert de Western28,37. Alternativement, la chimie du clic peut être effectuée sur le lysat cellulaire total et les protéines acylées grasses peuvent être purifiées par affinité pour identification par spectrométrie de masse. La réaction initiale de la chimie du clic avec l’azido-biotine a augmenté la sélectivité et la sensibilité de la détection plus d’un million de fois par rapport à la radioactivité2. Un autre avantage de la chimie du clic est qu’elle peut être combinée avec d’autres méthodes de marquage classiques, telles que l’analyse de chasse par impulsion du renouvellement des protéines à l’aide de l’azido-homoalanine pour l’analyse quantitative38. En outre, des sondes fluorescentes peuvent être utilisées à la place de la biotine ou d’autres sondes biochimiques, telles que les étiquettes FLAG ou Myc, afin d’examiner la localisation des protéines16,28,39.

Malgré la relative facilité d’utilisation de la chimie du clic, la détection peut être limitée par la faible solubilité et la toxicité potentielle de l’utilisation d’acides gras libres à longue chaîne en culture cellulaire40. En particulier, malgré la préférence du palmitate pendant l’acylation S pour la majorité des protéines, de nombreuses études ont utilisé le stéarate de 18 carbones (acide 17-octadécynoïque – 17-ODYA) plutôt que le palmitate (15-HDYA) pour détecter les protéines S-acylées en raison de sa disponibilité commerciale et de son coût relativement faible. Cependant, 17-ODYA est très insoluble et nécessite une attention particulière lors de son utilisation. En outre, la chimie du clic peut nécessiter une préparation et un stockage nuancés des produits chimiques. Ici, le protocole décrit une approche d’étiquetage, qui optimise l’administration en utilisant la saponification des acides gras, l’administration avec de la BSA sans acides gras et du sérum bovin fœtal délipidé (FBS) pour augmenter la solubilité et contourner les effets toxiques potentiels de l’ajout d’acides gras libres aux cellules28. Cette méthode fonctionne dans une variété de types de cellules et a même été utilisée chez des animaux vivants28.

Protocol

1. Culture cellulaire Pour compléter le DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) pour la culture cellulaire, ajoutez 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 1x pénicilline-streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 100 mM de pyruvate de sodium (1% vol / vol). Plaquez environ 5 x 105 cellules HEK293T / puits d’une boîte de culture tissulaire à 6 puits et cultivez pendant 18 h dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 5% de CO2 pour atteindre 75% à 80% de confluence. Privation de sérum d’acides gras Pour préparer le support d’étiquetage, préparez le DMEM comme ci-dessus (étape 1.1) sans FBS à 10 %. Remplacez FBS par FBS revêtu de dextran dextran(DCC-FBS) à 5 %. Préchauffer à 37 °C avant utilisation. Lavez doucement les cellules avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à température ambiante et remplacez-les par un support d’étiquetage.REMARQUE: Les cellules HEK293T se détachent facilement des plaques de culture tissulaire. Faites attention lorsque vous lavez les cellules et remplacez les supports. Minimisez autant que possible l’agitation pendant le transfert vers et depuis l’incubateur. Renvoyer les cellules dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 et incuber environ 45 min (minimum 15 min est efficace), jusqu’à 60 min, avant de procéder au marquage métabolique avec des acides gras. 2. Préparation et saponification d’analogues d’acides gras Préparer les solutions mères d’acides gras alcynyliques à l’avance en solubilisant dans du DMSO pour atteindre les concentrations suivantes et les conserver à -20 °C. Décongeler à température ambiante au besoin. Stockez les préparations pour leur meilleure performance sous N2 ou Ar.Myristate d’alcynyle (acide 13-tétradécynoïque, 13-TDYA) : 25 mMPalmitate d’alcynyle (acide 15-hexadécynoïque; 15-HDYA): 100 mMAlkynyl-stéarate (acide 17-octadécynoïque; 17-ODYA): 100 mM Pour préparer 20% de BSA sans acides gras (FAFBSA), peser 2 g de FAFBSA dans un tube jetable de 50 mL. Porter jusqu’à 10 mL avec du DMEM préchauffé (37 °C). Mélanger par rotation d’extrémité à extrémité ou par vortex, et placer dans un bain-marie à 37 °C pour dissoudre complètement le FAFBSA. Utilisez un filtre de 0,2 μm pour filtrer le milieu. Aliquote dans des volumes d’environ 1 mL et conserver à -20 °C. Décongeler au besoin et réchauffer à 37 °C au bain-marie avant utilisation. Pour améliorer la solubilité des acides gras et des analogues d’acides gras, saponifiez en incubant avec un excès molaire de 20% d’hydroxyde de potassium (KOH) dans des flacons de réaction conique en verre de 3 mL.REMARQUE: Ces flacons permettent au sel de rester soluble tout en veillant à ce que le FAFBSA ne se fige pas à cause de la chaleur élevée. L’utilisation du verre empêche également les acides gras de coller au plastique. Pipeter au moins 2 μL d’analogue d’acide gras alcynyle directement au fond d’un flacon de réaction conique de 3 mL. Préparer 2 μL de lipide par puits d’une plaque de 6 puits utilisée (voir tableau 1).REMARQUE: En raison de l’hydrophobicité des acides gras, il est préférable de recouvrir l’extrémité de la pipette en tirant plusieurs fois le volume souhaité avant de le distribuer dans le flacon de réaction. Diluer 1 M KOH à des concentrations égales à 20 % d’excès molaire de l’étiquette de l’acide gras alcynyle (30 mM pour le 13-TDYA et 120 mM pour le 15-HDYA et le 17-ODYA). Pipeter une quantité égale de KOH dilué (1 μL : 1 μL d’acide gras : KOH) près du fond du flacon de réaction sur le bord du verre, de sorte que le volume distribué du KOH se mélange à l’acide gras. Fermez le couvercle du flacon et tapotez doucement pour mélanger les solutions.REMARQUE: Le mélange peut se solidifier rapidement, en particulier avec des longueurs croissantes de la chaîne hydrocarbonée de l’acide gras. Veillez à ne pas pipeter le solide (c.-à-d. ne pas mélanger par pipetage). Chauffer le flacon de réaction à 65 °C pendant environ 5 min, ou dès que l’acide gras est incorporé (la solution devient claire).REMARQUE: Les acides gras avec un plus grand nombre de carbones et une solubilité réduite, tels que le stéarate (17-ODYA), peuvent nécessiter des temps d’incubation plus longs pour être complètement incorporés dans le KOH à 65 ° C. Augmentez la température à 70 °C si nécessaire. Un bain-marie est préférable. Veillez à ce que le liquide ne s’évapore pas trop. Une fois que les acides gras sont entrés en solution et qu’il ne reste plus de solides visibles, pipette préavertissée à 20% FAFBSA de telle sorte que le rapport volumique des acides gras: KOH: FAFBSA soit de 1: 1: 50 pour atteindre une concentration finale de 20x acides gras alcynyliques liés à la BSA. Mélanger en pipetant de haut en bas. La solution semble généralement claire sans solides visibles.REMARQUE: En règle générale, tous les petits solides entreront en solution après l’incubation à 37 ° C. Incuber l’acide gras et le FAFBSA pendant 15 min à 37 °C.REMARQUE: L’étiquette saponifiée à ce stade est stable au-delà de 15 min.   Volume total du média (mL) Vol. acide gras ou analogue d’acide gras (μL) Vol. KOH (μL) Vol. 20% FAFBSA (μL) Volume total de l’étiquette saponifiée conjuguée à la BSA (μL) 4 4 4 200 208 2 2 2 100 104 Tableau 1 : Ratios d’étiquetage des acides gras saponifiés. Volumes expérimentaux d’acides gras, de KOH et de FAFBSA pour la saponification de l’étiquette des acides gras en fonction du volume de milieu utilisé. En tant que contrôle, répétez l’étape 2.3. avec des acides gras sans étiquette alcyne. Étiqueter les cellules avec 1/20 volume du conjugué acide gras-BSA 20x directement sur le milieu de famine (typiquement, 100 μL dans 2 mL de milieu/cellules) pour obtenir une concentration finale de 1 % de BSA et de 25 μM pour l’alcynyl-myristate, ou de 100 μM pour l’alcynyl-palmitate et l’alcynyl-stéarate.REMARQUE: Pour minimiser la quantité de perturbation physique aux cellules attachées, formez une gouttelette à l’extrémité de la pipette près de la surface du support au lieu de pipeter directement dans le support. Si vous utilisez des inhibiteurs de l’acylation, ajoutez au moins 15 minutes avant les acides gras marqués. Les temps peuvent varier en fonction des cellules ou de l’inhibiteur utilisés. Il a été recommandé d’utiliser également la saponification pour cette étape28. À titre de comparaison, ajouter des lipides non saponifiés en pipetant 2 μL (ou l’équivalent du volume saponifié) d’acide gras non marqué directement dans le milieu de famine. Replacez les cellules dans l’incubateur et incubez pendant 3 à 6 h.REMARQUE : Il peut être nécessaire de déterminer le moment optimal de l’étiquetage pour chaque type de cellule ou condition expérimentale. Des temps d’incubation plus longs peuvent potentiellement conduire à la dégradation des acides gras par β-oxydation et/ou incorporation dans d’autres groupes lipidiques, tels que les phospholipides28. Lavez doucement les cellules avec 1x PBS à température ambiante. Récolter et lyser les cellules avec 500 μL d’acide radio-immunoprécipitation modifié (EDTA) tampon (RIPA) (0,1 % de SDS, 50 mM de N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-éthanesulfonique) pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 % de détergent non dénaturant, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 2 mM MgCl2 avec 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) fraîchement ajouté et 10 μg/μL de pepstatine A (ou cocktail d’inhibiteurs complets de protéase sans EDTA)) en balançant les lysats pendant 15 min à 4 °C. Centrifuger les lysats à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Recueillir le surnageant dans des tubes de microcentrifugation de 1,7 mL et le conserver à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à procéder à la réaction de clic.REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les lysats sont stables à -20 °C jusqu’à 1 mois. Cependant, il est recommandé de procéder à la réaction de clic en temps opportun. Quantifier les concentrations de protéines à l’aide d’un test approprié conformément au protocole du fabricant, tel qu’un test compatible avec les détergents (DC). 3. Cliquez sur réaction sur les lysats de cellules Préparez les réactifs pour la chimie du clic. Dissoudre la tris-(benzyltriazolylméthyl) amine (TBTA) dans le DMSO à 2 mM. Conserver dans de petites aliquotes avec un dessiccant à -20 °C jusqu’à 2-3 mois. Mieux conservé sous N2 ou Ar. Dissoudre CuSO4 dans l’eau ddH2O pour atteindre 50 mM. Conserver à température ambiante jusqu’à 2 mois. Dissoudre la tris-carboxyéthylphosphine (TCEP) dans l’eau ddH2O à 250 mM. Conserver dans l’obscurité à 4 °C et faire des dilutions fraîches de 50 mM juste avant la réaction de clic. Préparer 2 mM d’azoture dans le DMSO. Conserver dans de petites aliquotes avec un dessiccant à -20 °C jusqu’à 6 mois. Mieux conservé sous N2 ou Ar.REMARQUE: Il a été observé que les produits contenant trois groupes de polyéthylène glycols ou plus fonctionnaient mieux avec la biotine. Porter 50 à 100 μg de lysats de protéines dans des tubes de microcentrifugation de 1,7 mL au même volume en utilisant le même tampon de lyse que ci-dessus.REMARQUE: Gardez le volume de réaction aussi petit que possible (20-100 μL). Ajouter le sulfate de dodécyle de sodium (SDS) à chaque échantillon pour atteindre une concentration finale de 1 %. Préparez un mélange maître de réactifs de clic de sorte que les concentrations finales après addition aux lysats soient : 100 μM TBTA (stock 2 mM), 1 mM CuSO4, (stock 50 mM), 1 mM TCEP (stock 50 mM) et 100 μM sonde azide (stock 2 mM). Combiner les solutions mères en conséquence (voir tableau 2).REMARQUE: La commande est importante. Mélanger complètement après l’ajout de chaque composant. Ajoutez les volumes appropriés du mélange principal dans les lysats. Mélanger en pipetant de haut en bas. Incuber pendant 30 min dans l’obscurité dans un bain-marie à 37 °C. Agiter/mélanger de temps en temps. Vol total de réaction (μL) Protéine vol. (μL) Vol. TBTA (2 mM) (μL) Vol. CuSO4 (50 mM) (μL) Vol. TCEP (50 mM) (μL) Sonde Vol. azido (2 mM) (μL) 50 43 2.5 1 1 2.5 100 86 5 2 2 5 Tableau 2 : Rapports de volume des réactifs et des protéines. Volumes expérimentaux des réactifs de la chimie du clic et concentrations de stock correspondantes, en plus des volumes d’échantillons de protéines. 4. Cliquez sur la réaction sur les protéines immunoprécipitées Alternativement, il est possible d’effectuer la réaction de clic sur des protéines immunoprécipitées (IP) sur ou hors des billes.REMARQUE: En règle générale, en cliquant sur les perles, il est préférable de cliquer sur les perles et de tester de nouvelles protéines d’intérêt. Transfecter les cellules pour la protéine d’intérêt, dans ce cas, la huntingtine C-terminale myristylée de type sauvage (HTT) fusionnée à la GFP (myr-ctHTT-GFP) et à la ctHTT-GFP avec une substitution G2A, en utilisant la coprécipitation de l’ADN du phosphate de calcium, comme décrit précédemment41. Plaque 2,5 x 105 cellules / puits dans des plaques de culture tissulaire à 6 puits et croître pendant la nuit jusqu’à ~ 70-80% de confluence. Préparez le mélange d’ADN en ajoutant 2,5 μg d’ADN dans 10 μL avec 99,75 μL de H2O de qualité moléculaire à un tube de microcentrifugation de 1,7 mL. Ensuite, ajoutez 15,25 μL de CaCl2 goutte à goutte au mélange d’ADN. Ajouter le mélange ADN/CaCl2 dans un tube séparé contenant 125 μL 2x solution saline tamponnée HEPES (HBS, pH 7,0) de manière goutte à goutte avec mélange. Ajoutez lentement le mélange ADN/CaCl2/HBS aux cellules. Après 2-4 h, remplacez le support et incubez pendant la nuit. Procédez à l’étiquetage des étapes 1.3 à 2.8. Préparer des volumes égaux de protéines de 500 μg dans un tampon de lyse. Effectuer l’IP en incubant avec un anti-GFP de lapin pour ctHTT-GFP tournant pendant la nuit à 4 ° C. Ajouter 15 à 20 μL de billes de protéine G prééquilibrées avec tampon de lyse à chaque tube et laisser réagir bout à bout à 4 °C pendant 3 h. Lavez les billes avec un tampon de lyse et remettez en suspension dans un tampon HEPES de 45 μL à 1 % SDS 50 mM. Chauffer les billes à 80 °C pendant 15 min et inverser les tubes ou agiter environ toutes les 5 min. Faites tourner brièvement les tubes et revenez à 80 °C. Prélever le surnageant contenant les protéines pendant que les échantillons sont encore chauds.REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici et les échantillons immunoprécipités peuvent être stockés à -20 ° C ou -80 ° C, s’ils ne sont pas utilisés immédiatement pour la chimie du clic. Laissez 43 μL du surnageant réagir avec un mélange maître de 7 μL de réactifs de clic. Procéder à la réaction comme indiqué à l’étape 3.2.3. 5. SDS-PAGE et Western Blotting Arrêtez la réaction et dénaturez en ajoutant 1x tampon de chargement d’échantillon contenant 25 mM de dithiothréitol (DTT) et de la chaleur à 95 °C pendant 5 min.REMARQUE: Jusqu’à 100 mM DTT peuvent être utilisés28. N’utilisez pas de β-mercaptoéthanol avec des protéines S-acylées car il peut hydrolyser les liaisons thioester et éliminer l’analogue d’acide gras cliqué. Faites tourner brièvement les échantillons. Séparer les protéines avec SDS-PAGE sur un gel de polyacrylamide, en double.REMARQUE: Deux gels sont nécessaires pour le traitement alcalin avec KOH pour confirmer la présence de liaisons thioester. Si vous utilisez une sonde d’azoture fluorescente, l’acylation peut être détectée dans le gel ou après le transfert en utilisant le canal d’excitation indiqué. Transfert sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF) (activées dans du méthanol et rincées en ddH2O – 5 min chacune) avec un appareil de transfert semi-sec à 25 V, 1,0 A (constant) pendant 30 min. Après avoir brièvement rincé les membranes avec du ddH2O, faire tremper une membrane répliquée dans 0,1 M KOH dans du méthanol/eau (9:1 v/v) et l’autre dans 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 dans du méthanol/eau (9:1 v/v) comme témoin non alcalin pendant 60 min à température ambiante avec un balancement doux. Rincez brièvement les membranes à l’eau ddH2O, puis 6 fois de lavage de 5 minutes dans PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween 20).REMARQUE: Lavez-vous soigneusement. Bloquez les membranes pendant la nuit dans un tampon bloquant le lait écrémé à 5% (1x PBS, 0,1% Tween20). 6. Effectuer le transfert Western Lorsque cela est indiqué, sondez avec de la streptavidine marquée par fluorescence (1:5000) et un contrôle de charge, anti-GAPDH rhodamine (1:5000) dans un tampon bloquant 5% BSA (0,01% SDS, 1x PBS, 0,1% Tween20) à température ambiante pendant 45-60 min avec un léger balancement, dans l’obscurité. Sondez d’abord le transfert de protéine immunoprécipitée avec un anticorps anti-GFP primaire dans un tampon bloquant le lait écrémé à 5%, puis avec des anticorps secondaires appropriés dans du BSA à 5% comme à l’étape 6.1. Lavez les membranes pendant 5 min dans du PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween20) un total de quatre répétitions et rincez à l’eau ddH2O avant l’imagerie.

Representative Results

La différence d’efficacité de marquage entre les acides gras alcynyliques saponifiés et non saponifiés (non sève) pour la détection de la chimie du clic peut être visualisée et comparée par l’intensité du signal des protéines acylées grasses par transfert western (Figure 1). Un effet notable a été observé avec l’augmentation de la longueur des chaînes acyles. Dans les cellules marquées avec de l’alcynyl-stéarate (alk-stear), la saponification de l’acide gras et l’administration de BSA pour le marquage métabolique ont considérablement augmenté la détection du signal de la protéine S-acylée par la chimie du clic et la détection par une sonde azido fluorescente (Figure 1, à droite), suggérant une augmentation globale de l’incorporation cellulaire de l’étiquette de l’acide gras alcynyle. Inversement, aucune différence notable n’a été observée dans les cellules traitées avec l’acide gras le plus court et le plus soluble, l’alcynyl-myristate (alc-myr; acide 13-tétradécynoïque ou 13-TDYA). Les cellules marquées avec de l’alcynyl-palmitate (Figure 1, milieu) ont montré une augmentation intermédiaire de l’étiquette par rapport à l’alcynyl-myristate (13-TDYA), mais inférieure à l’alcynyl-stéarate. Il est important de noter que le traitement des membranes PVDF avec 0,1 M koh a largement éliminé les étiquettes d’acides gras des cellules incubées avec de l’alcynyl-palmitate et de l’alcynyl-stéarate, confirmant que la majorité du signal provenait d’une liaison ester ou thioester (Figure 1, milieu et droite, panneaux inférieurs). Comme prévu, l’incorporation d’alcynyl-myristate était principalement résistante aux alcalis (Figure 1, à gauche, panneaux inférieurs), en raison de la fixation du myristate aux protéines par une liaison amide. La figure 2 illustre la polyvalence et la sensibilité de la chimie du clic pour détecter l’acylation graisseuse des protéines immunoprécipitées. Les cellules HEK293T ont été transfectées avec de la huntingtine C-terminale myristylée (HTT) fusionnée à la GFP (myr-ctHTT-GFP) et marquées avec du myristate d’alcynyle, comme décrit précédemment18. Après l’immunoprécipitation, le ctHTT-GFP a été libéré des billes et soumis à une chimie de clic aux côtés des lysats. Non seulement la myristoylation du type sauvage (WT) myr-ctHTT-GFP a été détectée dans les immunoprécipités, mais elle a été fortement détectée dans les lysats, tandis que la mutation G2A a complètement bloqué la myristoylation du ctHTT-GFP (Figure 2). Figure 1 : Détection de protéines acylées grasses à l’aide de la chimie du clic. Les cellules HEK293T ont été incubées avec les acides gras indiqués directement (non-sève) ou après saponification (sève) et incubation avec la protéine porteuse BSA, comme décrit dans le protocole 2.1-2.7. Les acides gras alcynyliques ont été liés à l’azoture fluorescent en soumettant 100 μg de lysats de protéines à la chimie du clic, séparés par SDS-PAGE et transférés dans des membranes PVDF. Après traitement avec 0,1 M Tris pH 7,0 ou 0,1 M KOH, pour inverser les liaisons thioester, une acylation graisseuse a été détectée à l’aide d’un azoture fluorescent. GAPDH a été utilisé comme contrôle de chargement; anti-GAPDH rhodamine (1:5 000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Détection de CtHTT-GFP n-myristylée à l’aide de la chimie du clic. Les cellules HEK293T ont été transfectées avec une forme C-terminale tronquée (ct) et myristylatable de HTT (myr-ctHTT-GFP) et marquées avec du myristate d’alcynyle. Une forme non myristylatable avec la glycine essentielle remplacée par une alanine a été incluse (G2A). Après la récolte et la lyse, le ctHTT-GFP a été immunoprécipité à l’aide d’anti-GFP de chèvre. Les lysats ont été soumis à une réaction chimique de clic (à gauche) ainsi qu’à des immunoprécipités après la libération des billes. La myristoylation a été détectée à l’aide de Streptavidin Alexa 680 (SA680). GFP a été détecté en utilisant l’anti-GFP de lapin en combinaison avec l’anti-lapin Alexa 488. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Schéma de flux de travail du protocole expérimental. Aperçu du flux de travail des principales étapes expérimentales du protocole. Plusieurs points sont notés où le protocole peut être mis en pause. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’ajout direct d’acides gras aux cellules en culture peut entraîner une insolubilité, une précipitation des lipides et une lipotoxicité40. Par conséquent, l’ajout d’acides gras directement aux cellules peut non seulement entraîner une mauvaise absorption cellulaire et une faible disponibilité de l’étiquette des acides gras, mais aussi une diminution du nombre de cellules viables pour l’analyse en aval, ainsi que l’activation des voies hors cible. Cependant, de nombreux protocoles de marquage métabolique pour la détection de la chimie du clic impliquent l’ajout direct d’acides gras et un grand nombre d’études sur le palmitoyl-protéome utilisant la détection de la chimie du clic à ce jour saponifient rarement les étiquettes des acides gras ou les incubent avec BSA8,36. Il est important de considérer le fait que l’efficacité et la sensibilité de la détection de la chimie du clic des protéines acylées grasses dépendent d’une absorption cellulaire suffisante des analogues des acides gras. Par conséquent, il est raisonnable de spéculer que de nombreuses protéines S-acylées peuvent avoir échappé à la détection dans les études protéomiques en raison d’une faible disponibilité des étiquettes d’acides gras en raison d’une mauvaise incorporation dans les cellules, en particulier lorsque l’acide gras à chaîne plus longue 17-ODYA a été utilisé. Le 17-ODYA, ou alcynyl-stéarate, a été l’étiquette de choix largement utilisée pour plusieurs études en raison de sa disponibilité commerciale et de son utilisation précoce8,36. Cependant, les résultats de ce protocole démontrent que la saponification du 17-ODYA entraîne la plus grande augmentation de la détection des protéines S-acylées, par rapport aux acides gras à chaîne plus courte tels que le palmitate ou le myristate. Par conséquent, la répétition de ces expériences avec des étiquettes saponifiées peut donner des substrats supplémentaires d’acylation S qui ont peut-être été négligés auparavant. En outre, alors que la plupart des palmitoyl acyltransférases préfèrent le palmitate pour l’acylation S, certains ont des préférences pour d’autres longueurs d’acides gras tels que le stéarate15,38,44. De plus, certaines protéines ou même des sites spécifiques au sein des protéines préfèrent un acide gras à un autre15,45. Par conséquent, les études utilisant 17-ODYA peuvent avoir un biais vers les protéines S-acylées avec du stéarate, et non du palmitate, tout en sous-représentant ces protéines en raison d’une détection plus faible.

L’amélioration de l’efficacité du marquage métabolique pour la chimie du clic repose sur la saponification des lipides et l’incubation avec les étapes FAFBSA, ainsi que sur le FBS délipidé. Tous les acides gras doivent être complètement saponifiés dans le KOH sans qu’il ne reste de solides visibles avant de procéder à l’incubation avec FAFBSA. Cela peut être une étape difficile et le timing est crucial. Une fois que les acides gras saponifiés sont entrés en solution à 65 ° C, ajoutez immédiatement du BSA chaud, car un chauffage supplémentaire provoquera l’évaporation du DMSO des acides gras. De plus, l’étiquette saponifiée commencera à se solidifier dès qu’elle commencera à refroidir. Par conséquent, le FAFBSA doit être chaud et ajouté rapidement après que le sel soit devenu soluble. Les flacons de réaction en verre et leur forme sont importants pour cette étape. Ils permettent au lipide saponifié d’être suffisamment chaud pour rester soluble, tout en étant suffisamment froid pour s’assurer que le FAFBSA ne se fige pas. Un mélange suffisant par pipetage est également important à cette étape pour assurer une solution homogène pour l’étiquetage.

Les réactifs pour la chimie du clic doivent être correctement stockés, généralement avec des dessiccants ou sous gaz N2 ou Ar à -20 °C à -80 °C. L’absence de signal d’acylation ou de signal faible peut être due à des réactifs instables, en particulier des solutions souches de TBTA et d’azoture plus anciennes. En outre, il faut faire attention aux solutions mères d’azoture fluorescentes, qui doivent être protégées autant que possible de la lumière. En outre, des variables telles que la méthode de privation lipidique et le temps de marquage peuvent devoir être testées pour déterminer les conditions optimales en fonction du type de cellule utilisée. Par exemple, les cellules neuronales peuvent avoir besoin de temps d’étiquetage plus longs parce que les changements de médias et la privation de lipides sont difficiles (non publié).

L’avantage de ce protocole est plus spectaculaire lorsqu’il est utilisé pour les acides gras à chaîne longue. Pour les chaînes plus courtes, l’augmentation de l’intensité du signal devient moins dramatique, mais est toujours susceptible de protéger les cellules. Bien que les modifications suggérées amélioreront la détection de l’acylation des protéines en général, la chimie du clic est toujours considérée comme une méthode centrée sur les lipides1 qui se limite à la détection de protéines S-acylées dynamiquement et non stables1. D’autres limitations à considérer incluent l’exigence de privation d’acides gras pour favoriser le marquage, et sa gamme relativement limitée de types cellulaires compatibles par rapport à la détection de l’échange acyl-biotine (ABE) de l’acylation S16. Malgré ces limitations, la détection de la chimie du clic est plus rapide que la plupart des tests d’échange d’acyle et convient mieux à la détection de protéines qui ne tolèrent pas les étapes répétées de précipitation des protéines requises pour les essais d’échange d’acyle. En outre, cette approche peut être combinée avec un étiquetage simultané à l’aide d’autres tests de clic tels que l’analyse de chasse par impulsions38.

L’utilisation de cette modification pour le marquage métabolique pour la chimie du clic a augmenté la détection globale des protéines acylées, en particulier S-acylées, avec une variété de techniques protéomiques utilisées en conjonction avec la chimie du clic. Comme on le voit, la détection fluorogénique peut être utilisée comme alternative à la biotine (Figure 1)28. Ceci est particulièrement utile car il n’y a pas de protéines fluorescentes endogènes dans les lysats cellulaires. De plus, les fluorophores qui ne sont activés qu’après la chimie du clic peuvent être utilisés46. L’acide gras saponifié et lié à la FAFBSA pour le marquage chimique du clic peut aider à détecter les protéines d’intérêt en raison d’une augmentation globale de la quantité d’étiquette disponible dans la cellule et en limitant les effets toxiques de l’ajout d’acides gras directement dans le milieu. Il peut également être utilisé en conjonction avec la spectrométrie de masse27 pour augmenter la détection des protéines de faible abondance, en particulier lorsqu’il est combiné avec les progrès récents utilisant des algorithmes d’apprentissage automatique empêchant les mesures redondantes d’augmenter la sensibilité aux protéines de faible abondance, par opposition à l’acquisition existante dépendante des données qui favorise la détection des protéines les plus abondantes47 . En outre, la chimie du clic peut être combinée avec le marquage isotopique stable avec des acides aminés en culture cellulaire (SILAC) et des méthodes de chasse par impulsions pour produire des données quantifiables sur la protéine dynamique S-acylation27. Enfin, le groupe Hannoush a combiné la chimie du clic avec le test de ligature de proximité (PLA) pour permettre la visualisation et l’examen unicellulaires de la distribution subcellulaire des protéines palmitoylées43,48.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été financés par le Conseil national de recherches en sciences et en génie (CRSNG; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao a été financée par la bourse commémorative Ram et Lekha Tumkur par l’entremise du Département de biologie de l’Université de Waterloo et la bourse commémorative Lucy Morrison par l’entremise de l’IODE Ontario, en plus du financement de la recherche aux cycles supérieurs de l’Université de Waterloo, qui comprend la bourse d’études supérieures en recherche (50503-11072), la bourse d’études supérieures en sciences et l’assistanat d’enseignement aux cycles supérieurs. Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du laboratoire Martin pour leur soutien dans la préparation de ce manuscrit, en particulier Stephanie Ryall, Harleen Gill et Sadia Khan qui ont aidé à mettre en place initialement le Martin Lab en préparation de ces études. Les auteurs tiennent également à remercier le Dr Luc Berthiaume pour l’aimable don des constructions ctHTT-GFP et le Dr Shaun Sanders pour sa contribution critique à la préparation du manuscrit. La figure 3 a été créée avec BioRender.com.

Materials

13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM) Click Chemistry Tools 1164
15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM) Click Chemistry Tools 1165
17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM) Cayman Chemical Company 90270
30% acrylamide/bis solution 29:1 Biorad 1610156
96-well plate reader Biorad N/A
AFDye 647 azide plus Click Chemistry Tools 1482
Ammonium persulfate (APS) Biorad 1610700
Anti-GAPDH hFAB Rhodamine Biorad 12004167
Anti-rabbit Alexa 488 Invitrogen A11034
Anti-Tubulin hFAB Rhodamine Biorad 12004166
Biotin Azide Click Chemistry Tools 1265
Bis-tris, ultrapure VWR 715
Calcium chloride J.T. Baker 1332-1
Centrifuge 16,000xg, 4°C Thermo Scientific N/A
Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS) Life Technologies A3382101
ChemiDoc Imager Biorad N/A
Copper sulfate (1 mM) VWR BDH9312
Deoxycholic acid sodium salt monohydrate MP Biomedicals 102906
Detergent compatible (DC) assay Biorad N/A
Dimethyl sulfoxide (DMSO) VWR 0231-500 mL
DMEM, 1x Wisent Inc 319015CL
Ethanol, anhydrous N/A N/A
Fatty Acid Free BSA MP Biomedicals 219989950
Fast Blot Turbo Semi-dry transfer Biorad N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12483-020
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane Pall Life Sciences BSP0161
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid VWR 5011
Humidified Incubator at 37°C and 5% CO2 VWR N/A
Igepal CA-630 Alfa Aesar J61055
Image Lab Software Biorad N/A
L-glutamine supplement solution Wisent Inc 609-065-EL
Magnesium chloride Fisher Scientific BP214-500
Methanol VWR BDH1135
Myristic Acid (25 mM) VWR M0476-25G
Palmitic acid (100 mM) VWR P0002-25G
Penicillin-Streptomycin, 10x Wisent Inc 450201EL
Pepstatin A (synthetic) Enzo Life Sciences ALX-260-085-M005
Phenylmethylsulfonyl fluoride Enzo Life Sciences ALX-270-184-G005
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 VWR 75801-000
Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified) Eusera EU4
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane Pall Life Sciences BSP0161
Potassium hydroxide Ward's Science 470302-100
Rabbit polyclonal antibody to GFP Eusera EU1
Sodium chloride VWR 0241-1KG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Sodium pyruvate Wisent Inc 600-110-EL
Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate Thermo Fisher Scientific S21378
Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM) Click Chemistry Tools 1061
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM) Soltec Ventures M115
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Trypsin/EDTA Wisent Inc 325-043-CL
Tween 20 Reagent Grade 1L VWR 97062-332
WHEATON NextGen V Vials 3 mL VWR 89085-424
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Referencias

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Liao, L. M. Q., Gray, R. A. V., Martin, D. D. O. Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry. J. Vis. Exp. (170), e62107, doi:10.3791/62107 (2021).
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