Un sistema de purificación de proteínas de alto rendimiento económico y versátil que utiliza un adaptador de placa multicolumna
Summary
Un adaptador de placa multicolumna permite que las columnas de cromatografía se interconectan con placas de recolección de múltiples pozos para la afinidad paralela o la purificación del intercambio iónico, proporcionando un método económico de purificación de proteínas de alto rendimiento. Se puede utilizar bajo gravedad o vacío produciendo cantidades de miligramos de proteína a través de instrumentación asequible.
Abstract
La purificación de proteínas es imprescindible para el estudio de la estructura y función de las proteínas y generalmente se utiliza en combinación con técnicas biofísicas. También es un componente clave en el desarrollo de nuevas terapias. La era en evolución de la proteómica funcional está alimentando la demanda de purificación de proteínas de alto rendimiento y técnicas mejoradas para facilitar esto. Se planteó la hipótesis de que un adaptador de placa de múltiples columnas (MCPA) puede interconectar múltiples columnas de cromatografía de diferentes resinas con placas de múltiples pozos para la purificación paralela. Este método ofrece un método económico y versátil de purificación de proteínas que se puede utilizar bajo gravedad o vacío, rivalizando con la velocidad de un sistema automatizado. El MCPA se puede utilizar para recuperar los rendimientos de miligramos de proteína por un método asequible y eficiente en el tiempo para su posterior caracterización y análisis. El MCPA se ha utilizado para la purificación de afinidad de alto rendimiento de dominios SH3. El intercambio iónico también se ha demostrado a través del MCPA para purificar la proteína post Ni-NTA cromatografía de afinidad, lo que indica cómo este sistema se puede adaptar a otros tipos de purificación. Debido a su configuración con múltiples columnas, la personalización individual de los parámetros se puede hacer en la misma purificación, inalcanzable por los métodos basados en placas actuales.
Introduction
Las técnicas de purificación de proteínas para lograr cantidades de miligramos de proteínas purificadas son imprescindibles para su caracterización y análisis, especialmente para métodos biofísicos como la RMN. La purificación de proteínas también es fundamental en otras áreas de estudio, como los procesos de descubrimiento de fármacos y los estudios de interacción proteína-proteína; sin embargo, alcanzar tales cantidades de proteína pura puede convertirse en un cuello de botella para estas técnicas1,2,3. El método principal para la purificación de proteínas es la cromatografía, que incluye una variedad de métodos que se basan en las características individuales de las proteínas y sus etiquetas. En cromatografía de afinidad, las proteínas tienen un motivo proteico o peptídico adicional que funciona como una etiqueta que tiene afinidad por un determinado sustrato en la resina de cromatografía4. El método de afinidad más común es la cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) utilizando proteínas his-tagged, mientras que otro método popular es la cromatografía de intercambio iónico que separa las proteínas en función de su carga. Para obtener la mayor pureza, una combinación de cromatografía de afinidad e intercambio iónico se utiliza con frecuencia juntos, por lo general requieren costosos equipos de laboratorio para un alto rendimiento.
La era evolutiva de la proteómica funcional está alimentando la demanda de técnicas de alto rendimiento para purificar no proteínas singulares para análisis específicos, sino un gran número de proteínas simultáneamente para análisis exhaustivos y estudios de genoma completo5. La cromatografía de afinidad metálica inmovilizada (IMAC) es uno de los métodos más utilizados para la purificación de proteínas de alto rendimiento6,7, sinembargo,sus sistemas automatizados son costosos e inasequibles para laboratorios más pequeños8. Las alternativas basadas en placas más asequibles que están disponibles actualmente emplean el uso de equipos de laboratorio accesibles, como el vacío. Aunque estos métodos tienen éxito en la mejora de la velocidad de purificación, sólo puede lograr la purificación de alto rendimiento en una escala más pequeña, sólo el rendimiento de proteínas en el rango de microgramos. Estas limitaciones significan que las placas de filtro de 96 pozos preenvasadas (por ejemplo, de GE Healthcare ahora propiedad de Cytiva) no se pueden utilizar antes de las técnicas biofísicas9. La cromatografía por gravedad es el método de purificación más rentable; sin embargo, la configuración de múltiples columnas es inconveniente y puede ser propensa a errores para múltiples proteínas.
Se ha desarrollado un adaptador de placa de múltiples columnas (MCPA) y se ha demostrado que ejecuta con éxito y convenientemente columnas de cromatografía de afinidad paralela a la vez para purificar los dominios SH3 de levadura con etiqueta His10. El MCPA ofrece un método de purificación de alto rendimiento rentable que no depende de una instrumentación costosa. Su diseño flexible puede purificar eficazmente miligramos de proteína por múltiples columnas de cromatografía de afinidad bajo gravedad o variedad de vacío. Además, el tipo de resina, el volumen y otros parámetros se pueden ajustar para cada columna individual para una optimización más rápida. Este estudio demuestra que la cromatografía del intercambio iónico por el MCPA se puede utilizar conjuntamente con la cromatografía de la afinidad por el MCPA para realzar la purificación del dominio Abp1 SH3. Además, hasta 24 proteínas diferentes se pueden separar en paralelo utilizando estos métodos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método es robusto y fácil de usar para bioquímicos de proteínas relativamente inexpertos, sin embargo, hay algunas consideraciones a tener en cuenta.
Precaución sobre el sobrellenado de placas de recogida
La placa de recolección de 48 pozos en sí solo tiene 5 mL por pozo, mientras que cada 96 pozos solo tiene 2 mL. Esto debe tenerse en cuenta al agregar el búfer y ejecutar la muestra a través de la columna, ya que existe el riesgo de lle…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención P20GM103451 y una beca de investigación interna de la Universidad de Liverpool.
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
Referencias
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