Um sistema econômico e versátil de purificação de proteínas de alto rendimento usando um adaptador de placa de várias colunas
Summary
Um adaptador de placa de várias colunas permite que as colunas de cromatografia sejam interfaceadas com placas de coleta multi-poços para afinidade paralela ou purificação de troca de íons, proporcionando um método econômico de purificação de proteínas de alto rendimento. Pode ser usado sob gravidade ou vácuo produzindo quantidades de miligramas de proteína através de instrumentação acessível.
Abstract
A purificação de proteínas é imprescindível para o estudo da estrutura e função proteica e geralmente é usada em combinação com técnicas biofísicas. É também um componente-chave no desenvolvimento de novas terapêuticas. A era em evolução da proteômica funcional está alimentando a demanda por purificação de proteínas de alto rendimento e técnicas aprimoradas para facilitar isso. Foi a hipótese de que um adaptador de placa de várias colunas (MCPA) pode interagir múltiplas colunas de cromatografia de diferentes resinas com placas multi-poço para purificação paralela. Este método oferece um método econômico e versátil de purificação de proteínas que pode ser usado sob gravidade ou vácuo, rivalizando com a velocidade de um sistema automatizado. O MCPA pode ser usado para recuperar o rendimento de miligramas de proteína por um método acessível e eficiente de tempo para caracterização e análise subsequentes. O MCPA tem sido usado para purificação de afinidade de alto rendimento dos domínios SH3. A troca de íons também foi demonstrada através do MCPA para purificar a cromatografia de afinidade proteína pós-Ni-NTA, indicando como este sistema pode ser adaptado a outros tipos de purificação. Devido à sua configuração com várias colunas, a personalização individual dos parâmetros pode ser feita na mesma purificação, inalcançável pelos métodos atuais baseados em placas.
Introduction
Técnicas de purificação de proteínas para alcançar quantidades miligramas de proteínas purificadas são imprescindíveis à sua caracterização e análise, especialmente para métodos biofísicos como a RMR. A purificação de proteínas também é central em outras áreas de estudo, como processos de descoberta de medicamentos e estudos de interação proteína-proteína; no entanto, alcançar tais quantidades de proteína pura pode se tornar um gargalo para essas técnicas1,2,3. O principal método de purificação de proteínas é a cromatografia, que inclui uma variedade de métodos que dependem das características individuais das proteínas e suas tags. Na cromatografia de afinidade, as proteínas têm um motivo adicional de proteína ou peptídeo que funciona como uma etiqueta que tem afinidade por um certo substrato na resina cromatografia4. O método de afinidade mais comum é a cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC) usando proteínas marcadas por His, enquanto outro método popular é a cromatografia de troca de íons que separa proteínas com base em sua carga. Para a maior pureza, uma combinação de cromatografia de afinidade e troca de íons é frequentemente usada em conjunto, geralmente exigindo equipamentos de laboratório caros para alta produtividade.
A era em evolução da proteômica funcional está alimentando a demanda por técnicas de alto rendimento para purificar proteínas não singulares para análise específica, mas um grande número de proteínas simultaneamente para análise abrangente e estudos de genoma5. A cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC) é um dos métodos mais utilizados para purificação de proteínas de alta produtividade6,7, mas seus sistemas automatizados são caros e inacessíveis para laboratórios menores8. As alternativas mais acessíveis à base de placas que estão atualmente disponíveis empregam o uso de equipamentos acessíveis baseados em laboratório, como um vácuo. Embora esses métodos sejam bem sucedidos em melhorar a velocidade de purificação, ele só pode alcançar purificação de alto rendimento em menor escala, produzindo apenas proteína na faixa de microgramas. Essas limitações significam que as placas de filtro de 96 poços pré-embaladas (por exemplo, da GE Healthcare agora de propriedade da Cytiva) não podem ser utilizadas antes das técnicas biofísicas9. A cromatografia gravitacional é o método de purificação mais econômico; no entanto, configurar várias colunas é inconveniente e pode ser propenso a erros para múltiplas proteínas.
Um adaptador de placa de várias colunas (MCPA) foi desenvolvido e comprovado para executar com sucesso e convenientemente colunas de cromatografia de afinidade paralela de uma só vez para purificar os domínios SH3 com sua marca marcada10. O MCPA oferece um método de purificação de alto rendimento econômico que não depende de instrumentação dispendia. Seu design flexível pode efetivamente purificar miligramas de proteína por múltiplas colunas de cromatografia de afinidade sob gravidade ou coletor de vácuo. Além disso, o tipo de resina, o volume e outros parâmetros podem ser ajustados para cada coluna individual para uma otimização mais rápida. Este estudo demonstra que a cromatografia de troca de íons pelo MCPA pode ser usada em conjunto com a cromatografia de afinidade pelo MCPA para melhorar a purificação do domínio Abp1 SH3. Além disso, até 24 proteínas diferentes podem ser separadas em paralelo usando esses métodos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método é robusto e simples de usar para bioquímicos de proteínas relativamente inexperientes, no entanto, há algumas considerações a serem consideradas.
Cuidado com o excesso de placas de coleta
A placa de coleta de 48 poços em si contém apenas 5 mL por poço, enquanto cada 96-well possui apenas 2 mL. Isso precisa ser mantido em mente ao adicionar buffer e executar a amostra através da coluna, pois há o risco de encher demais os poços….
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada por um Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de bolsas P20GM103451 e uma bolsa de pesquisa interna da Universidade de Liverpool.
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
Referencias
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