Ein wirtschaftliches und vielseitiges Hochdurchsatz-Proteinreinigungssystem mit einem Mehrsäulenplattenadapter

Proteinreinigungstechniken, um Milligrammmengen an gereinigten Proteinen zu erreichen, sind für ihre Charakterisierung und Analyse unerlässlich, insbesondere für biophysikalische Methoden wie NMR. Die Proteinreinigung ist auch in anderen Studienbereichen wie Arzneimittelentdeckungsprozessen und Protein-Protein-Interaktionsstudien von zentraler Bedeutung. Das Erreichen solcher Mengen an reinem Protein kann jedoch zu^einemEngpass für diese Techniken werden 1^,2,3. Die Hauptmethode zur Proteinreinigung ist die Chromatographie, die eine Vielzahl von Methoden umfasst, die auf den individuellen Eigenschaften von Proteinen und ihren Tags basieren. In der Affinitätschromatographie haben Proteine ein zusätzliches Protein- oder Peptidmotiv, das als Tag fungiert, das eine Affinität für ein bestimmtes Substrat auf dem Chromatographieharz^{4 aufsät.} Die gebräuchlichste Affinitätsmethode ist die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) mit His-markierten Proteinen, während eine andere beliebte Methode die Ionenaustauschchromatographie ist, die Proteine basierend auf ihrer Ladung trennt. Für höchste Reinheit wird häufig eine Kombination aus Affinitätschromatographie und Ionenaustausch zusammen verwendet, was in der Regel teure Laborgeräte für einen hohen Durchsatz erfordert.

Die sich entwickelnde Ära der funktionellen Proteomik befeuert die Nachfrage nach Hochdurchsatztechniken, um nicht einzelne Proteine für spezifische Analysen, sondern eine große Anzahl von Proteinen gleichzeitig für umfassende Analysen und genomweite Studien zu reinigen⁵. Die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) ist eine der am weitesten verbreiteten Methoden zur Hochdurchsatzproteinreinigung^6,7, aber ihre automatisierten Systeme sind teuer und für kleinere Labore unerschwinglich⁸. Die erschwinglicheren plattenbasierten Alternativen, die derzeit verfügbar sind, verwenden zugängliche Laborgeräte wie ein Vakuum. Obwohl diese Methoden die Reinigungsgeschwindigkeit erfolgreich verbessern, kann sie nur in kleinerem Maßstab eine Hochdurchsatzreinigung erreichen und nur Protein im Mikrogrammbereich liefern. Diese Einschränkungen bedeuten, dass die vorverpackten 96-Well-Filterplatten (z. B. von GE Healthcare, die jetzt im Besitz von Cytiva sind) nicht vor biophysikalischen Techniken verwendet werden können⁹. Die Schwerkraftchromatographie ist die kostengünstigste Reinigungsmethode. Das Einrichten mehrerer Spalten ist jedoch umständlich und kann für mehrere Proteine fehleranfällig sein.

Ein Mehrsäulenplattenadapter (MCPA) wurde entwickelt und bewährt, um parallele Affinitätschromatographiesäulen gleichzeitig erfolgreich und bequem auszuführen, um his-markierte Hefe-SH3-Domänen zu reinigen¹⁰. Der MCPA bietet eine kosteneffiziente Hochdurchsatz-Reinigungsmethode, die nicht auf kostspielige Instrumentierung angewiesen ist. Sein flexibles Design kann Milligramm Protein durch mehrere Affinitätschromatographiesäulen unter Schwerkraft oder Vakuumverteiler effektiv reinigen. Darüber hinaus können Harztyp, Volumen und andere Parameter für jede einzelne Säule angepasst werden, um eine schnellere Optimierung zu erreichen. Diese Studie zeigt, dass die Ionenaustauschchromatographie durch das MCPA in Verbindung mit der Affinitätschromatographie durch das MCPA verwendet werden kann, um die Aufreinigung der Abp1 SH3-Domäne zu verbessern. Zusätzlich können mit diesen Methoden bis zu 24 verschiedene Proteine parallel getrennt werden.