Examinando la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular
Summary
La regeneración del músculo esquelético es impulsada por las células madre musculares residentes en el tejido, que se ven afectadas en muchas enfermedades musculares, como la distrofia muscular, y esto resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. Aquí, describimos un protocolo que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.
Abstract
El músculo esquelético tiene una notable capacidad para regenerarse después de una lesión, que es impulsada por células madre musculares residentes en el tejido obligado. Después de la lesión, la célula madre muscular se activa y sufre proliferación celular para generar un grupo de mioblastos, que posteriormente se diferencian para formar nuevas fibras musculares. En muchas condiciones de desgaste muscular, incluida la distrofia muscular y el envejecimiento, este proceso se ve afectado, lo que resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. El proceso de regeneración muscular en el pez cebra está altamente conservado con sistemas de mamíferos que proporcionan un excelente sistema para estudiar la función y regeneración de las células madre musculares, en condiciones de desgaste muscular como la distrofia muscular. Aquí, presentamos un método para examinar la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular. El primer paso consiste en el uso de una plataforma de genotipado que permite la determinación del genotipo de las larvas antes de provocar una lesión. Una vez determinado el genotipo, el músculo se lesiona mediante una puñalada con aguja, tras la cual se utiliza la microscopía de luz polarizante para determinar el grado de regeneración muscular. Por lo tanto, proporcionamos una tubería de alto rendimiento que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.
Introduction
El músculo esquelético representa el 30-50% de la masa corporal humana, y no solo es indispensable para la locomoción, sino que también sirve como un órgano metabólico y de almacenamiento crítico1. A pesar de ser postmitótico, el músculo esquelético es altamente dinámico y conserva una tremenda capacidad regenerativa después de una lesión. Esto se atribuye a la presencia de células madre residentes en tejidos (también llamadas células satélite), localizadas bajo la lámina basal de miofiberes y marcadas por los factores de transcripción pareados de proteína de caja 7 (pax7)y/o proteína de caja pareada 3 (pax3),entre otros2,3. Después de la lesión, la célula satélite se activa y sufre proliferación celular para generar un grupo de mioblastos, que posteriormente se diferencian para formar nuevas fibras musculares. La cascada altamente conservada de señales pro-regenerativas que regulan la activación de las células satélite y la reparación muscular robusta se ve afectada en diversas condiciones, como las miopatías y el envejecimiento homeostático4,5.
Uno de estos grupos diversos de miopatías es la distrofia muscular, caracterizada por desgaste muscular progresivo y degeneración6. Estas enfermedades son consecuencia de mutaciones genéticas en proteínas clave, entre ellas la distrofina y la laminina-α2 (LAMA2), responsables de la unión de las fibras musculares a la matriz extracelular7,8. Dado que las proteínas implicadas en la distrofia muscular juegan un papel tan central en el mantenimiento de la estructura muscular, durante muchos años se creyó que un fallo en este proceso era el mecanismo responsable de la patogénesis de la enfermedad9. Sin embargo, estudios recientes han identificado defectos en la regulación de las células madre musculares y el posterior deterioro en la regeneración muscular como segunda posible base para la patología muscular observada en la distrofia muscular10,11. Como tal, se necesitan más estudios para investigar cómo un deterioro en la función de las células madre musculares y los elementos de nicho asociados contribuyen a la distrofia muscular.
Durante la última década, el pez cebra(Danio rerio)se ha convertido en un importante modelo de vertebrados para el modelado de enfermedades12. Esto se atribuye al rápido desarrollo externo del embrión de pez cebra, junto con su claridad óptica, que permite la visualización directa de la formación muscular, el crecimiento y la función. Además, no solo el desarrollo y la estructura del músculo están altamente conservados en el pez cebra, sino que también muestran un proceso altamente conservado de regeneración muscular13. En consecuencia, el pez cebra representa un excelente sistema para estudiar la patobiología de las enfermedades musculares y explorar cómo se ve afectada la regeneración muscular en ella. Con este fin, hemos desarrollado un método que permite el estudio oportuno de la regeneración del músculo esquelético en modelos de pez cebra de enfermedad muscular. Esta tubería de alto rendimiento implica un método para genotipar embriones vivos14,después del cual se realiza una lesión por apuñalamiento con aguja y se toma una imagen del grado de regeneración muscular mediante microscopía de luz polarizante. Por lo tanto, la utilización de esta técnica revelará la capacidad regenerativa del músculo en modelos de enfermedad muscular de pez cebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
La regeneración del músculo esquelético está impulsada por células madre musculares residentes en el tejido obligado, cuya función se altera en muchas enfermedades musculares como la distrofia muscular, impidiendo posteriormente el proceso de regeneración muscular. Aquí, describimos un protocolo de alto rendimiento para examinar la regeneración muscular en modelos vivos de pez cebra de enfermedad muscular. El primer paso de la tubería utiliza una plataforma de genotipado de embriones14,q…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al Dr. Alex Fulcher y a Monash Micro Imaging por su ayuda con el mantenimiento y la configuración del microscopio. El Instituto Australiano de Medicina Regenerativa cuenta con el apoyo de subvenciones del Gobierno del Estado de Victoria y el Gobierno de Australia. Este trabajo fue financiado por una subvención del proyecto de la Asociación de Distrofia Muscular (EE.UU.) a P.D.C (628882).
Materials
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
Referencias
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).
- Emery, A. E. H. . Duchenne muscular dystrophy. , (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
