Изучение регенерации мышц в моделях мышечных заболеваний рыбок данио
Summary
Регенерация скелетных мышц обусловлена тканевыми мышечными стволовыми клетками, которые нарушаются при многих мышечных заболеваниях, таких как мышечная дистрофия, и это приводит к неспособности мышц к регенерации. Здесь мы опишем протокол, который позволяет идировать регенерацию мышц у рыбок данио моделей мышечных заболеваний.
Abstract
Скелетные мышцы имеют замечательную способность к регенерации после травмы, которая обусловлена облигатными тканевыми резидентными мышечными стволовыми клетками. После травмы мышечная стволовая клетка активируется и подвергается пролиферации клеток для создания пула миобластов, которые впоследствии дифференцируются с образованием новых мышечных волокон. При многих состояниях мышечного истощения, включая мышечную дистрофию и старение, этот процесс нарушается, что приводит к неспособности мышц к регенерации. Процесс регенерации мышц у рыбок данио хорошо сохраняется с системами млекопитающих, обеспечивающими отличную систему для изучения функции и регенерации мышечных стволовых клеток в условиях мышечного истощения, таких как мышечная дистрофия. Здесь мы представляем метод изучения регенерации мышц в моделях мышечных заболеваний рыбок данио. Первый шаг включает в себя использование платформы генотипирования, которая позволяет определить генотип личинок до получения травмы. Определив генотип, мышцу травмируют с помощью игольчатого удара, после чего для определения степени регенерации мышц используется поляризационная световая микроскопия. Таким образом, мы обеспечиваем высокопроизводительный конвейер, который позволяет проводить исследование регенерации мышц в моделях мышечных заболеваний рыбок данио.
Introduction
Скелетные мышцы составляют 30-50% массы тела человека, и не только незаменимы для передвижения, но и служат критическим метаболическим и накопительныморганом1. Несмотря на постмитотическую емкость, скелетные мышцы очень динамичны и сохраняют огромную регенеративную способность после травмы. Это объясняется наличием тканевых резидентных стволовых клеток (также называемых клетками-сателлитами), расположенных под базальной пластинкой миофиберов и отмеченных факторами транскрипции парного коробчатого белка 7 (pax7) и / или парного коробчатого белка 3 (pax3), среди прочих2,3. После повреждения клетка-сателлит активируется и подвергается пролиферации клеток для создания пула миобластов, которые впоследствии дифференцируются с образованием новых мышечных волокон. Высокосохраняющийся каскад прорегенеративных сигналов, регулирующих активацию спутниковых клеток и надежное восстановление мышц, поражается при различных состояниях, таких как миопатии и гомеостатическое старение4,5.
Одной из таких разнообразных групп миопатий является мышечная дистрофия, характеризующаяся прогрессирующим истощением мышц и дегенерацией6. Эти заболевания являются следствием генетических мутаций в ключевых белках, включая дистрофин и ламинин-α2 (LAMA2), отвечающих за прикрепление мышечных волокон к внеклеточному матриксу7,8. Учитывая, что белки, замешанные в мышечной дистрофии, играют такую центральную роль в поддержании мышечной структуры, в течение многих лет считалось, что сбой в этом процессе был механизмом, ответственным за патогенез заболевания9. Однако последние исследования выявили дефекты регуляции мышечных стволовых клеток и последующее нарушение регенерации мышц как вторую возможную основу мышечной патологии, наблюдаемой при мышечной дистрофии10,11. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, как нарушение функции мышечных стволовых клеток и связанных с ними нишевых элементов способствует мышечной дистрофии.
За последнее десятилетие рыбка данио(Danio rerio)стала важной моделью позвоночных для моделирования заболеваний12. Это объясняется быстрым внешним развитием эмбриона рыбки данио в сочетании с его оптической ясностью, которая позволяет непосредственно визуализировать формирование, рост и функцию мышц. Кроме того, у рыбок данио не только высоко сохраняется развитие и структура мышц, но и высоко консервативный процесс регенерации мышц13. Следовательно, рыбки данио представляют собой отличную систему для изучения патобиологии мышечных заболеваний и изучения того, как в ней влияет регенерация мышц. С этой целью мы разработали метод, позволяющий своевременно изучать регенерацию скелетных мышц у рыбок данио моделей мышечных заболеваний. Этот высокопроизводительный конвейер включает в себя метод генотипирования живых эмбрионов14,после которого выполняется травма иглой и степень регенерации мышц визуализируется с помощью поляризационной световой микроскопии. Таким образом, использование этого метода выявит регенеративную способность мышц в моделях мышечных заболеваний рыбок данио.
Protocol
Representative Results
Discussion
Регенерация скелетных мышц обусловлена облигатными тканевыми резидентными мышечными стволовыми клетками, функция которых изменяется при многих мышечных заболеваниях, таких как мышечная дистрофия, впоследствии препятствуя процессу регенерации мышц. Здесь мы описываем протокол высо…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить доктора Алекса Фулчера и Monash Micro Imaging за помощь в обслуживании и настройке микроскопа. Австралийский институт регенеративной медицины поддерживается грантами правительства штата Виктория и правительства Австралии. Эта работа была профинансирована грантом проекта Ассоциации мышечной дистрофии (США) P.D.C (628882).
Materials
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
Referencias
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).
- Emery, A. E. H. . Duchenne muscular dystrophy. , (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
