Модель ксенотрансплантата мышиной оммая для изучения прямой таргетной терапии лептоменингеальной болезни

Протокол был одобрен Комитетом по институциональным уходу и использованию животных Университета Южной Флориды (IS00005974). 1. Внедрение CTC в CSF для генерации модели LMD мыши Подготовка ЦОД Рассчитайте количество ЦОК, необходимых для инъекции, и приготовьте одноклеточную суспензию при 1,0 ×10 4 клетки/мкл в стерильном фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS). Поместите клеточную суспензию на лед или при 4 °C на протяжении всей процедуры.ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании клеточных линий, требующих трипсинизации, обязательно промывайте клетки дважды стерильным PBS для удаления трипсина. Выполняйте подсчет клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Если используется большая когорта (>50 мышей), пересчет клеток и проверка жизнеспособности клеток между инъекциями, чтобы обеспечить постоянное количество клеток на мышь. Предоперационная процедура Вводят мышам подкожно 1 мг/кг бупренорфина пролонгированного высвобождения (Bup-SR).ПРИМЕЧАНИЕ: Не вводите в область предполагаемого разреза; выбрать место инъекции далеко от лопатки. Обезболивайте мышь 2-3% изофлураном до тех пор, пока у нее не проявится признаки правотекательного рефлекса. Кроме того, проверьте рефлекс защемления хвоста и / или лапы, чтобы подтвердить состояние анестезии. Подготовьте мышь к операции в месте, удаленном от операционной зоны. Обрежь хирургическое место (т.е. дорсальную поверхность черепа) с достаточной площадью границы, чтобы мех не загрязнял место разреза; затем насытить участок бактерицидным антисептиком кожи, работающим от центра участка до периферии, а затем дать высохнуть. Нанесите либо стерильную драпировку, либо стерильный пластиковый драпировочный материал с адгезивной основой для защиты места операции от загрязнения.ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты должны быть заранее автоклавированы, а наконечники повторно стерилизованы между животными с использованием стерилизатора из стеклянных шариков. Сбрить мех всей вентральной поверхности головы, и подготовить кожу с помощью стерильной техники. Распорядить нос модифицированным L-образным носовым конусом стереотаксического аппарата, гарантируя, что нары остаются чистыми и открытыми. Используя ленту через вентральные поверхности обеих пинн, осторожно потяните кожу вперед, чтобы закрепить ее на носовом конусе, и согните шею под углом примерно 90° после закрепления. Вводят 1,5% изофлурана для поддержания анестезии.ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное позиционирование приведет к тому, что область разреза будет представлена таким образом, чтобы можно было легко идентифицировать хвостовой гребень затылочной кости. Расположите тело, чтобы позвоночник поддерживался на одном уровне с cisterna magna, и, применяя небольшое сцепление с хвостом, поместите ленту у основания хвоста, чтобы закрепить. Хирургическая инъекция цистерны магна С шеей в полном разгибании и начиная только между шнеками, провести кончики хирургических ножниц вниз с небольшим давлением через затылочную кость.ПРИМЕЧАНИЕ: Находясь в этом положении средней линии, небольшое углубление заметно, когда кончики ножниц опускаются в вогнутую область над цистерной magna. Сделайте небольшой разрез средней линии 3-5 мм чуть выше пальпированной вогнутости. Втяни 5 мкл клеточной суспензии при 1,0 ×10 4 клетки/мкл (всего 5,0 ×10 4 клетки) в шприц Гамильтона 30 г. Используйте щипцы с тупыми наконечниками с 1-2 мм, чтобы осторожно надавить на цистерну magna. Введите наконечники в закрытое положение и открывайте их, применяя нисходящее давление на твердое мозговое средство. Повторяйте тупое рассечение, описанное на предыдущем этапе, до тех пор, пока дуральная мембрана не будет легко идентифицирована, и связанные с ней кровеносные сосуды не будут видны в открытой области.ПРИМЕЧАНИЕ: Полученное окно инъекции гарантирует, что кровеносные сосуды не будут повреждены во время введения иглы. Удерживая щипцы открытыми для втягивания окружающей мускулатуры, введите 30-жидную иглу без корочивания под твердое расстояние, чтобы визуализировать скос. Убедитесь, что игла вводится только сразу за самой скосой. Медленно разверните шприцевой поршень и доставьте ячейки чуть ниже твердой мозговой оболочки. Правильно поместите скос, чтобы наблюдать за инъекцией под твердой мозговой оболочкой. Осторожно вводите технику и используйте иглу 30 G без пробоотбора, чтобы предотвратить повреждение мембраны и обеспечить минимальную утечку. Если отмечена утечка, нанесите мягкое давление с помощью аппликатора с хлопковым наконечником. Закройте кожу, нанеся раневой зажим или микро-каплю кожного клея. Как только инъекция будет успешно выполнена, позвольте мышам оправиться от анестезии на теплом одеяле, наблюдая за ними непрерывно, пока они не смогут сохранить стернальное положение и продемонстрировать целенаправленное движение. Наследуйте за мышами ежедневно после операции в течение первой недели. Если мышь испытывает боль или дистресс, обработайте ее подкожной инъекцией карпрофена 10 мг / кг один раз в 12-24 ч в течение 5 дней на основе ветеринарной консультации и директивы. Позвольте мышам восстановиться и контролировать их в течение как минимум 48-72 ч, прежде чем перейти к следующему шагу.ПРИМЕЧАНИЕ: Bup-SR, данный превентивно, будет длиться до 72 ч, поэтому дополнительные анальгетики обычно не нужны. Однако животным будет предоставлен дополнительный анальгетик по мере необходимости (если вялый, не едный, взъерошенный). Если в месте операции развиваются признаки послеоперационной инфекции (например, покраснение, отек, болезненность, аллодиния, гипералгезия, гиперпатия или нагноение), или если мышь охраняет пораженный участок, усыплите мышь. Если раковые клетки успешно введены в ликвор, ЛМД и опухолевая прогрессия будут развиваться в ЦНС в течение 1 или 2 недель (в зависимости от типов используемых ЦОК или клеточной линии)(рисунок 1). 2. Сборка и имплантация Murine Ommaya Подготовка станции Продезинфицируйте поверхность станции. Поместите синее покрытие на поверхность и держите наготове все стерилизованные инструменты и расходные материалы, указанные на рисунке 2. Предоперационная процедура Применяют анальгезию (Bup-SR) и поддерживают стерильную технику, как описано в разделе 1.2. Хирургическая имплантация мышиной оммая Соберите инжекторное устройство Murine Ommaya с помощью миниатюрного инжекционного отверстия 25 G (наружный диаметр 0,51 мм) и проставочной дисковой дисковой диском диаметром 1 мм. Используйте цианоакрилатный стерильный клей для обеспечения проникновения примерно 2,5 мм металлической канюли в правое полушарие головного мозга(рисунок 3А-С).ПРИМЕЧАНИЕ: В этой лаборатории был разработан МРТ-совместимый прототип мыши Ommaya, который уже имеет обе части (миниатюрный инжекционный порт и распорку), напечатанные 3D-печатью вместе как единое целое(рисунок 3D). Версия с одним блоком была протестирована с помощью МРТ и может сэкономить время, исключив этап сборки. Обезболивают мышь 2-3% изофлураном до тех пор, пока не покинется признаки правотекающего рефлекса. Кроме того, проверьте рефлекс защемления хвоста и / или лапы, чтобы подтвердить состояние анестезии. Сбрить всю вентральную поверхность головки меха, и подготовить кожу по стерильной методике, как описано ранее в шаге 1.2.3. Поместите мышь в стереотаксический аппарат с носовым конусом для продолжения введения изофлурана во время процедуры; снизить изофлуран до 1,5%. Осторожно затяните ушные вкладыши, чтобы закрепить голову, и нанесите смазку для глаз, чтобы прикрыть глаза мыши. Делают небольшой разрез кожи (3 мм) с последующим тупым рассечением подлежащих подкожных тканей для обнажения черепа. Высушите череп с помощью пропитанных перекисью водорода аппликаторных палочек с хлопковым наконечником. Просверлите отверстие в черепе 0,5 мм с задней и 1,1 мм боковой от брегмы — анатомическую точку на черепе, где корональный шов перпендикулярно пересекается сагиттальным швом(рисунок 3А),— а также отверстие для заусенцев 0,9 мм, чтобы обнажить твердое мозговое отверстие. Отведите микродрень в сторону и аккуратно окуйте кость, непосредственно окружающую отверстие заусенца, прежде чем вставлять инъекционный порт (глубина примерно 2,5 мм), прикрепленный к черепу с помощью цианоакрилатного стерильного клея. Состояние шва вокруг места инъекции с использованием 4-0 неабсорбирующих нейлоновых швов в прерываемом рисунке стежка или пучкового струнного шва11. Размещайте послеоперационных мышей в отдельных клетках для хирургического восстановления.ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что мышиная оммайя может оторваться, когда несколько выздоровенные хирургическим путем мыши находятся в одной клетке, возможно, из-за постоянных взаимодействий с вмешательством. Рекомендуется, чтобы мыши, имплантированные Murine Ommaya, размещались индивидуально (или не более 2 мышей на клетку) в течение всего испытания эффективности препарата. 3. Лечение мышиной оммая Дозирование мышей с помощью мышиной оммайи Обезболивают мышь 2-3% изофлураном, пока не покинется признаки выпрямляющего рефлекса. Кроме того, проверьте рефлекс защемления хвоста и / или лапы, чтобы подтвердить поддержание анестезии. Доступ к Murine Ommaya с помощью адаптера впрыска порта и шприца Hamilton. Используя щипцы, удерживайте верхнюю часть миниатюрного порта впрыска и аккуратно вставьте адаптер инжектора порта полностью в перегородку порта.ПРИМЕЧАНИЕ: Инжектор порта прокалывает перегородку порта таким образом, чтобы уменьшить мертвое пространство до минимума и обеспечить контролируемый впрыск через моторизованный шприцевой насос(рисунок 4A). Таргетные/новые методы лечения вводят со скоростью потока 1 мкл/мин под наркозом. Лечение должно проводиться через определенные промежутки времени (ежедневно / еженедельно) в течение установленной продолжительности (недели / месяцы), по усмотрению исследователя.Объем от 3 до 7 мкл является оптимальным, так как объем 7 мкл может вызвать слишком большое давление. Размер шприца Гамильтона может варьироваться от 10 до 100 мкл, в зависимости от количества мышей в каждой лечебной руке. Предварительная загрузка соответствующего объема в шприц Гамильтона предотвратит повторную замену шприца, тем самым минимизируя ошибки. Лучше всего посвятить 1 шприц Гамильтона на руку лечения. После того, как инъекция сделана, отсоедините Murine Ommaya от адаптера для инъекции порта с помощью щипцов и верните мышь в клетку для восстановления после анестезии, как описано выше на этапе 1.3.7. Эвтаназия Усыпленить мышей путем вдыхания углекислого газа (CO2)из источника сжатого резервуара. Подвергайте мышей воздействию возрастающих концентраций CO2 (т.е. следует использовать скорость смещения от 10% до 30% объема камеры в минуту), чтобы избежать или свести к минимуму дискомфорт или дистресс. На мониторах мышей до уверенности в прекращении сердечно-сосудистых и дыхательных движений.