研究利普托梅宁格疾病直接靶向治疗的穆林·奥马亚异种格拉夫特模型

该协议得到了南佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IS00005974）的批准。 1. 将CTC注入CSF，生成鼠标LMD模型 CTC 的准备工作 计算注射所需的CTC数量，在无菌磷酸盐缓冲盐（PBS）中，在1.0×104 细胞/μL下制备单细胞悬浮。在整个过程中将细胞悬浮在冰上或在 4 °C 下。注意：当使用需要尝试的细胞系时，请务必用无菌 PBS 清洗细胞两次以去除试用素。使用血细胞计或自动细胞计数器执行细胞计数。如果使用大群（>50只小鼠），在注射之间重新计算细胞并验证细胞的生存能力，以确保每只小鼠管理一致数量的细胞。 术前手术 用1毫克/千克丁丙诺啡皮下注射小鼠持续释放（Bup-SR）。注：不要注入拟切口的面积：选择远离肩骨的注射部位。 用2-3%异黄素麻醉鼠标，直到它没有表现出正确的反射迹象。此外，检查尾巴和/或爪捏反射，以确认麻醉状态。 在远离手术区域的位置为小鼠准备手术。将手术部位（即头骨的正部表面）夹上足够的边界区域，以防止毛皮污染切口部位;然后，用抗腐剂使部位饱和，从部位中心工作到周围，然后允许干燥。应用无菌窗帘或无菌胶粘剂支持的塑料窗帘材料，以保护手术现场免受污染。注：仪器应提前自动封存，并用玻璃珠消毒器在动物之间重新消毒。 剃掉头部整个腹腔表面的毛皮，并使用无菌技术准备皮肤。 用立体定向装置的改装 L 形鼻锥定位鼻子，确保鼻孔保持清晰和开放。使用胶带穿过两个针眼的腹腔表面，轻轻地将皮肤向前拉，将其固定在鼻锥上，并在固定后以大约 90° 角弯曲颈部。管理1.5%异黄素以维持麻醉。注：适当的定位将导致切口区域以便于识别腹骨的烧灼脊的方式呈现。 将身体定位以确保脊柱与西斯特纳巨无霸保持水平，同时对尾部施加轻微牵引力，将胶带放在尾部底部以固定。 手术西斯特纳麦格纳注射 随着颈部的完全延伸，并开始只是之间的针刺，运行手术剪刀尖向下与轻微的压力穿过腹腔骨。注：虽然在这个中线位置，当剪刀尖浸入西斯特纳巨无霸的凹面区域时，一个小的凹陷是明显的。 在苍白的凹面上方做一个3-5毫米的中线切口。将 5 μL 的细胞悬浮在 1.0 × 104 细胞/μL（总计 5.0 ×10 4 个细胞）中绘制成 30 G Hamilton 注射器。 使用具有 1-2 mm 尖端的钝尖钳子轻轻按压西斯特纳巨无霸。在封闭式位置引入提示，并在对 dura 施加向下压力时打开提示。 重复前一步描述的钝解剖，直到杜拉尔膜很容易识别，相关血管在暴露区域可见。注：由此产生的注射窗口确保血管在插入针头时未受损。 当将钳子打开以收回周围的肌肉时，在杜拉下引入一根30G的非结扎针，以可视化斜面。确保针头只引入斜面本身之外。慢慢地部署注射器柱塞，并在杜拉正下方输送细胞。 正确放置斜面，观察杜拉下方的注射。小心管理该技术，并使用30G非胸针，以防止对膜的损害，并确保最小的泄漏。如果注意到泄漏，请使用棉尖施用器施加温和的压力。 通过涂抹伤口夹或皮肤粘合剂的微滴来关闭皮肤。注射成功后，让小鼠在温暖的毯子上从麻醉中恢复过来，持续观察它们，直到它们能够保持胸骨位置并表现出有目的的运动。 手术后第一周每天监测小鼠。如果小鼠似乎处于疼痛或痛苦之中，根据兽医咨询和指示，每12至24小时注射10毫克/千克皮下注射一次卡洛芬，最长达5天。让小鼠恢复并监测它们至少48至72小时，然后再进入下一步。注意：Bup-SR，先发制人，将持续长达72小时，所以额外的镇痛药通常是没有必要的。然而，动物将根据需要提供额外的镇痛药（如果昏昏欲睡，不吃，皱褶）。如果手术部位出现术后感染迹象（即发红、肿胀、发嫩、同位素、高镇痛、超病或脓肿），或者如果小鼠在守卫受影响区域，则对小鼠实施安乐死。如果癌细胞成功注射到CSF中，LMD和肿瘤进展将在1或2周内在CNS中发展（取决于使用的CTC或细胞系的类型）（图1）。 2. 穆林·奥马亚组装和植入 车站准备 消毒站面。将蓝色覆盖物覆盖在表面上，并准备好 图2中指示的所有消毒工具和用品。 术前手术 应用镇痛 （Bup-SR）， 并保持第 1.2 节中描述的无菌技术。 穆林·奥马亚的手术植入 使用 25 G（0.51 mm 外径）微型喷射端口和 1 mm 隔膜盘组装 Murine Ommaya 喷射装置。使用氰丙烯酸酯无菌粘合剂，确保约2.5毫米的金属管进入右脑半球（图3A-C）。注：该实验室开发了一个与MRI兼容的鼠标Ommaya原型，该实验室已经将两个部件（微型喷射端口和隔膜）3D打印成一个单元（图3D）。单个单元版本由 MRI 测试，可以通过消除装配步骤节省时间。 用 2-3% 异黄素麻醉鼠标，直到没有右反射的迹象。此外，检查尾巴和/或爪捏反射，以确认麻醉状态。 剃掉毛皮头部的整个腹腔表面，并根据无菌技术准备皮肤，如先前在第1.2.3步中所述。将鼠标放在带有鼻锥的立体定向装置中，以便在手术过程中继续异黄素管理：将异黄素降至1.5%。轻轻地拧紧耳塞以固定头部，并涂抹眼部润滑剂以遮盖鼠标的眼睛。 做一个小的皮肤切口（3毫米），然后钝解剖底层皮下组织，以暴露头骨。使用过氧化氢浸泡棉尖施用棒干燥头骨。 在头骨 0.5 mm 后部和 1.1 mm 侧向的胸腔中钻一个毛刺孔 – 头骨上的解剖点，其中冠状缝合线被下垂缝合线 （图 3A）垂直交叉 – 以及一个 0.9 毫米毛刺孔，以暴露杜拉母体。将微褶皱移到一边，在插入注射端口（深度约 2.5 mm）之前，轻轻地在毛刺孔周围给骨头打分，然后使用氰化物无菌粘合剂贴在头骨上。注射点周围的国家缝合使用4-0无吸收尼龙缝合在中断的缝合模式或钱包字符串缝合11。 将手术后的小鼠关在单独的笼子里进行手术恢复。注：当多个手术康复的老鼠被安置在同一个笼子里时，Murine Ommaya可能会脱落，可能是由于不断的篡改相互作用。建议在药物疗效试验过程中，将植入的Murine Ommaya植入的小鼠单独安置（或每个笼子不超过2只小鼠）。 3. 穆林·奥马亚治疗 使用穆林奥马亚剂量小鼠 用2-3%异黄素麻醉鼠标，直到没有纠正反射的迹象。此外，检查尾巴和/或爪捏反射，以确认麻醉的维护。 使用端口注射适配器和汉密尔顿注射器访问穆林奥马亚。使用钳子，握住微型喷射端口的顶部，轻轻地将端口喷射器适配器完全插入端口的隔膜中。注：端口喷油器穿透端口隔膜的方式，将死空间减少到最低限度，并允许通过电动注射器泵进行受控注射（图4A）。在麻醉期间，以1微升/分钟的流动速度注射靶向/新疗法。根据研究人员的判断，治疗将按指定的时间间隔（每日/每周）进行，持续时间为固定时间（周/月）。3 到 7 μL 之间的音量是最佳的，因为 3 μL 体积可能会造成太大的压力。Hamilton 注射器的大小范围从 10 到 100 μL 不等，具体取决于每个治疗臂中的鼠标数量。将适当的音量预装到汉密尔顿注射器中将防止重复更换注射器，从而最大限度地减少错误。最好每个治疗手臂奉献 1 个汉密尔顿注射器。 注射后，使用钳子将 Murine Ommaya 从端口注射适配器中分离出来，并将鼠标放回笼中，从麻醉中恢复过来，如上文第 1.3.7 步所述。 安乐死 通过从压缩的水箱源中吸入二氧化碳（CO2），使老鼠安乐死。让小鼠暴露在二氧化碳 浓度增加的状态（即使用室积/分钟 10% 到 30% 的位移速率），以避免或尽量减少不适或苦恼。监测小鼠，直到保证停止心血管和呼吸运动。