Generierung und Aufbau virusspezifischer Nukleokapsiden des respiratorischen Synzytialvirus
Summary
Für eine eingehende mechanistische Analyse der RNA-Synthese des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) berichten wir über ein Protokoll zur Verwendung des Chaperonphosphoproteins (P) zur Koexpression des RNA-freien Nukleoproteins (N0)für die anschließende in vitro-Assemblierung der virusspezifischen Nukleokapside (NCs).
Abstract
Die Verwendung einer authentischen RNA-Vorlage ist entscheidend, um das grundlegende Wissen über die virale RNA-Synthese zu erweitern, das sowohl die mechanistische Entdeckung als auch die Assay-Entwicklung in der Virologie leiten kann. Die RNA-Vorlage von NNS-RNA-Viren (Nonsegmented Negative Sense) wie dem respiratorischen Synzytialvirus (RSV) ist kein RNA-Molekül allein, sondern ein Nukleoprotein (N) -verkapselter Ribonukleoproteinkomplex. Trotz der Bedeutung der authentischen RNA-Vorlage bleiben die Erzeugung und der Aufbau eines solchen Ribonukleoproteinkomplexes anspruchsvoll und erfordern eine eingehende Aufklärung. Die größte Herausforderung besteht darin, dass das überexprimierte RSV N unspezifisch an zelluläre RNAs bindet, um zufällige nukleokapsidähnliche Partikel (NCLPs) zu bilden. Hier haben wir ein Protokoll etabliert, um RNA-freies N (N0)zu erhalten, indem wir zuerst N mit einem Chaperonphosphoprotein (P) co-exprimieren und dann N0 mit RNA-Oligos mit der RSV-spezifischen RNA-Sequenz zusammensetzen, um virusspezifische Nukleokapside (NCs) zu erhalten. Dieses Protokoll zeigt, wie die Schwierigkeiten bei der Herstellung dieses traditionell herausfordernden viralen Ribonukleoproteinkomplexes überwunden werden können.
Introduction
Nicht segmentierte NNS-RNA-Viren (Negative Sense) umfassen viele signifikante menschliche Krankheitserreger wie Tollwut, Ebola und respiratorisches Synzytialvirus (RSV)1,2. RSV ist die Hauptursache für Atemwegserkrankungen wie Bronchiolitis und Lungenentzündung bei kleinen Kindern und älteren Erwachsenen weltweit3. Derzeit stehen keine wirksamen Impfstoffe oder antiviralen Therapien zur Verfügung, um RSV4zu verhindern oder zu behandeln. Als Teil des Lebenszyklus dient das RSV-Genom als Vorlage für die Replikation durch die RSV-RNA-abhängige RNA-Polymerase, um ein Antigenom zu produzieren, das wiederum als Vorlage für die Erzeugung eines Nachkommengenoms dient. Sowohl Genom- als auch Antigenom-RNAs werden vollständig durch das Nukleoprotein (N) verkapselt, um die Nukleokapsiden (NCs) zu bilden3. Da die NCs als Vorlagen für die Replikation und Transkription durch die RSV-Polymerase dienen, ist die richtige NC-Assemblierung entscheidend, damit die Polymerase Zugang zu den Vorlagen für die RNA-Synthese erhält5. Interessanterweise wird aufgrund der Strukturanalysen der NNS-Viruspolymerasen die Hypothese aufgestellt, dass mehrere N-Proteine vorübergehend von den NCs dissoziieren, um den Zugang der Polymerase zu ermöglichen und nach der RNA-Synthese wieder an RNA zu binden6,7,8,9,10,11,12.
Derzeit wurde der RSV-RNA-Polymerisationsassay unter Verwendung von gereinigter RSV-Polymerase auf kurzen nackten RNA-Vorlagen13,14etabliert. Die Aktivitäten der RSV-Polymerase erreichen jedoch nicht optimal, wie bei den nicht-prozessiven und abtreibenden Produkten beobachtet wird, die von der RSV-Polymerase bei der Verwendung nackter RNA-Schablonen erzeugt werden. Das Fehlen von NC mit virusspezifischer RNA ist eine primäre Barriere für das weitere mechanistische Verständnis der RSV-RNA-Synthese. Daher wird die Verwendung einer authentischen RNA-Vorlage zu einem kritischen Bedürfnis, um das grundlegende Wissen über die RSV-RNA-Synthese zu erweitern. Die bekannten Strukturen der nucleocapsid-like particles (NCLPs) von RSV und anderen NNS-RNA-Viren zeigen, dass die RNAs in den NCLPs entweder zufällige zelluläre RNAs oder durchschnittliche virale genomische RNAssind 15,16,17,18,19. Zusammen besteht die Haupthürde darin, dass N unspezifisch an zelluläre RNAs bindet, um NCLPs zu bilden, wenn N in den Wirtszellen überexprimiert wird.
Um diese Hürde zu überwinden, haben wir ein Protokoll erstellt, um zuerst RNA-freie (N0)zu erhalten und N0 mit authentischer viraler genomischer RNA zu NCLPs20zusammenzusetzen. Das Prinzip dieses Protokolls besteht darin, eine große Menge rekombinantes RNA-freies N (N0)zu erhalten, indem N mit einem Chaperon, der N-terminalen Domäne des RSV-Phosphoproteins (PNTD),co-exprimiert wird. Das gereinigteN0P konnte stimuliert und durch Zugabe von RSV-spezifischen RNA-Oligos zu NCLPs zusammengesetzt werden, und während des Assemblierungsprozesses wird das Chaperon PNTD durch die Zugabe von RNA-Oligos verdrängt.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Erzeugung und Densembierung von RSV-RNA-spezifischen NCs. In diesem Protokoll beschreiben wir das molekulare Klonen, die Proteinpräparation, die In-vitro-Assemblierung und die Validierung der komplexen Assemblierung. Wir stellen die Klonierungsstrategie zur Generierung bi-cistronischer Konstrukte für die Proteinkoexpression für das molekulare Klonen vor. Für die Proteinpräparation beschreiben wir die Verfahren der Zellkultur, Proteinextraktion und der Aufreinigung des Proteinkomplexes. Anschließend diskutieren wir die Methode zur in vitro Assemblierung der RSV-RNA-spezifischen NCs. Schließlich verwenden wir Größenausschlusschromatographie (SEC) und negative Färbungselektronenmikroskopie (EM), um die zusammengesetzten NCLPs zu charakterisieren und zu visualisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die bekannten Nukleokapsid-ähnlichen Partikelstrukturen (NCLP) der nicht segmentierten NNS-RNA-Viren (Negative-Sense) zeigen, dass die zusammengesetzten NCLPs das komplexe N mit wirszellulären RNAs sind, wenn sie in bakteriellen oder eukaryotischen Expressionssystemen überexprimiert werden15,16,17,18,19. Frühere Studien haben versucht, das RNA-freie N mit …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschungsprogramme im Liang-Labor in Emory werden vom US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), den National Institutes of Health (NIH) unter der Vergabenummer R01GM130950 und dem Research Start-Up Fund der Emory University School of Medicine unterstützt. Der Autor dankt den Mitgliedern des Liang-Labors für hilfreiche Unterstützung und kritische Diskussion.
Materials
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
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