Génération et assemblage de nucléoopsides spécifiques au virus du virus respiratoire syncytial

Les virus à ARN à sens négatif (NNS) non segmentés comprennent de nombreux agents pathogènes humains importants, tels que la rage, Ebola et le virus respiratoire syncytial (RSV)^1,2. Le RSV est la principale cause de maladies respiratoires telles que la bronchiolite et la pneumonie chez les jeunes enfants et les adultes plus âgés dans le monde³. À l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin ou traitement antiviral efficace pour prévenir ou traiter le RSV^4. Dans le cadre du cycle de vie, le génome du RSV sert de modèle pour la réplication par l’ARN polymérase dépendante de l’ARN du RSV pour produire un antigénique, qui à son tour agit comme modèle pour générer un génome de progéniture. Les ARN du génome et de l’antigène sont entièrement encapsulés par la nucléoprotéine (N) pour former les nucléocapsides (NCs)^3. Étant donné que les NCs servent de modèles pour la réplication et la transcription par la polymérase RSV, un assemblage NC approprié est crucial pour que la polymérase accède aux modèles pour la synthèse de l’ARN^5. Fait intéressant, sur la base des analyses structurelles des polymérases virales NNS, on émet l’hypothèse que plusieurs protéines N se dissocient transitoirement des NCs pour permettre l’accès de la polymérase et se rebinent à l’ARN après la synthèse de l’ARN^{6,7,8,9,10,11,12.}

Actuellement, le test de polymérisation de l’ARN RSV a été établi en utilisant de la polymérase RSV purifiée sur de courts modèles d’ARN nu^13,14. Cependant, les activités de la polymérase RSV n’atteignent pas optimales, comme observé dans les produits non processifs et abortifs générés par la polymérase RSV lors de l’utilisation de modèles d’ARN nu. L’absence de NC avec l’ARN spécifique au virus est un obstacle principal à la compréhension mécaniste de la synthèse de l’ARN du RSV. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle d’ARN authentique devient un besoin critique pour faire progresser les connaissances fondamentales de la synthèse de l’ARN du RSV. Les structures connues des particules de type nucléoscopique (NCLPs) provenant du RSV et d’autres virus à ARN NNS révèlent que les ARN dans les NCLPs sont soit des ARN cellulaires aléatoires, soit des ARN génomiques viraux moyens^{15,16,17,18,19.} Ensemble, le principal obstacle est que N se lie non spécifiquement aux ARN cellulaires pour former des NCLPs lorsque N est surexprimé dans les cellules hôtes.

Pour surmonter cet obstacle, nous avons établi un protocole pour obtenir d’abord sans ARN^(N0)et assembler^N0 avec de l’ARN génomique viral authentique en NCLPs^20. Le principe de ce protocole est d’obtenir une grande quantité de N^(N0)sans ARN recombinant en co-exprimant N avec un chaperon, le domaine N-terminal de la phosphoprotéine RSV (P_NTD). Le N⁰P purifié pourrait être stimulé et assemblé en NCLPs en ajoutant des oligos d’ARN spécifiques au RSV, et pendant le processus d’assemblage, le chaperon P_NTD est déplacé lors de l’ajout d’oligos d’ARN.

Ici, nous détaillons un protocole pour la génération et l’assemblage de CN spécifiques à l’ARN RSV. Dans ce protocole, nous décrivons le clonage moléculaire, la préparation de protéine, l’assemblage in vitro, et la validation de l’assemblage complexe. Nous mettons en évidence la stratégie de clonage pour générer des constructions bi-cistroniques pour la coexpression de protéines pour le clonage moléculaire. Pour la préparation des protéines, nous décrivons les procédures de culture cellulaire, d’extraction des protéines et de purification du complexe protéique. Ensuite, nous discutons de la méthode d’assemblage in vitro des CN spécifiques à l’ARN RSV. Enfin, nous utilisons la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et la microscopie électronique à taches négatives (EM) pour caractériser et visualiser les NCLPs assemblés.