Summary

Generierung und Aufbau virusspezifischer Nukleokapsiden des respiratorischen Synzytialvirus

Published: July 27, 2021
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Summary

Für eine eingehende mechanistische Analyse der RNA-Synthese des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) berichten wir über ein Protokoll zur Verwendung des Chaperonphosphoproteins (P) zur Koexpression des RNA-freien Nukleoproteins (N0)für die anschließende in vitro-Assemblierung der virusspezifischen Nukleokapside (NCs).

Abstract

Die Verwendung einer authentischen RNA-Vorlage ist entscheidend, um das grundlegende Wissen über die virale RNA-Synthese zu erweitern, das sowohl die mechanistische Entdeckung als auch die Assay-Entwicklung in der Virologie leiten kann. Die RNA-Vorlage von NNS-RNA-Viren (Nonsegmented Negative Sense) wie dem respiratorischen Synzytialvirus (RSV) ist kein RNA-Molekül allein, sondern ein Nukleoprotein (N) -verkapselter Ribonukleoproteinkomplex. Trotz der Bedeutung der authentischen RNA-Vorlage bleiben die Erzeugung und der Aufbau eines solchen Ribonukleoproteinkomplexes anspruchsvoll und erfordern eine eingehende Aufklärung. Die größte Herausforderung besteht darin, dass das überexprimierte RSV N unspezifisch an zelluläre RNAs bindet, um zufällige nukleokapsidähnliche Partikel (NCLPs) zu bilden. Hier haben wir ein Protokoll etabliert, um RNA-freies N (N0)zu erhalten, indem wir zuerst N mit einem Chaperonphosphoprotein (P) co-exprimieren und dann N0 mit RNA-Oligos mit der RSV-spezifischen RNA-Sequenz zusammensetzen, um virusspezifische Nukleokapside (NCs) zu erhalten. Dieses Protokoll zeigt, wie die Schwierigkeiten bei der Herstellung dieses traditionell herausfordernden viralen Ribonukleoproteinkomplexes überwunden werden können.

Introduction

Nicht segmentierte NNS-RNA-Viren (Negative Sense) umfassen viele signifikante menschliche Krankheitserreger wie Tollwut, Ebola und respiratorisches Synzytialvirus (RSV)1,2. RSV ist die Hauptursache für Atemwegserkrankungen wie Bronchiolitis und Lungenentzündung bei kleinen Kindern und älteren Erwachsenen weltweit3. Derzeit stehen keine wirksamen Impfstoffe oder antiviralen Therapien zur Verfügung, um RSV4zu verhindern oder zu behandeln. Als Teil des Lebenszyklus dient das RSV-Genom als Vorlage für die Replikation durch die RSV-RNA-abhängige RNA-Polymerase, um ein Antigenom zu produzieren, das wiederum als Vorlage für die Erzeugung eines Nachkommengenoms dient. Sowohl Genom- als auch Antigenom-RNAs werden vollständig durch das Nukleoprotein (N) verkapselt, um die Nukleokapsiden (NCs) zu bilden3. Da die NCs als Vorlagen für die Replikation und Transkription durch die RSV-Polymerase dienen, ist die richtige NC-Assemblierung entscheidend, damit die Polymerase Zugang zu den Vorlagen für die RNA-Synthese erhält5. Interessanterweise wird aufgrund der Strukturanalysen der NNS-Viruspolymerasen die Hypothese aufgestellt, dass mehrere N-Proteine vorübergehend von den NCs dissoziieren, um den Zugang der Polymerase zu ermöglichen und nach der RNA-Synthese wieder an RNA zu binden6,7,8,9,10,11,12.

Derzeit wurde der RSV-RNA-Polymerisationsassay unter Verwendung von gereinigter RSV-Polymerase auf kurzen nackten RNA-Vorlagen13,14etabliert. Die Aktivitäten der RSV-Polymerase erreichen jedoch nicht optimal, wie bei den nicht-prozessiven und abtreibenden Produkten beobachtet wird, die von der RSV-Polymerase bei der Verwendung nackter RNA-Schablonen erzeugt werden. Das Fehlen von NC mit virusspezifischer RNA ist eine primäre Barriere für das weitere mechanistische Verständnis der RSV-RNA-Synthese. Daher wird die Verwendung einer authentischen RNA-Vorlage zu einem kritischen Bedürfnis, um das grundlegende Wissen über die RSV-RNA-Synthese zu erweitern. Die bekannten Strukturen der nucleocapsid-like particles (NCLPs) von RSV und anderen NNS-RNA-Viren zeigen, dass die RNAs in den NCLPs entweder zufällige zelluläre RNAs oder durchschnittliche virale genomische RNAssind 15,16,17,18,19. Zusammen besteht die Haupthürde darin, dass N unspezifisch an zelluläre RNAs bindet, um NCLPs zu bilden, wenn N in den Wirtszellen überexprimiert wird.

Um diese Hürde zu überwinden, haben wir ein Protokoll erstellt, um zuerst RNA-freie (N0)zu erhalten und N0 mit authentischer viraler genomischer RNA zu NCLPs20zusammenzusetzen. Das Prinzip dieses Protokolls besteht darin, eine große Menge rekombinantes RNA-freies N (N0)zu erhalten, indem N mit einem Chaperon, der N-terminalen Domäne des RSV-Phosphoproteins (PNTD),co-exprimiert wird. Das gereinigteN0P konnte stimuliert und durch Zugabe von RSV-spezifischen RNA-Oligos zu NCLPs zusammengesetzt werden, und während des Assemblierungsprozesses wird das Chaperon PNTD durch die Zugabe von RNA-Oligos verdrängt.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Erzeugung und Densembierung von RSV-RNA-spezifischen NCs. In diesem Protokoll beschreiben wir das molekulare Klonen, die Proteinpräparation, die In-vitro-Assemblierung und die Validierung der komplexen Assemblierung. Wir stellen die Klonierungsstrategie zur Generierung bi-cistronischer Konstrukte für die Proteinkoexpression für das molekulare Klonen vor. Für die Proteinpräparation beschreiben wir die Verfahren der Zellkultur, Proteinextraktion und der Aufreinigung des Proteinkomplexes. Anschließend diskutieren wir die Methode zur in vitro Assemblierung der RSV-RNA-spezifischen NCs. Schließlich verwenden wir Größenausschlusschromatographie (SEC) und negative Färbungselektronenmikroskopie (EM), um die zusammengesetzten NCLPs zu charakterisieren und zu visualisieren.

Protocol

1. Molekulares Klonen HINWEIS: Ligase Independent Cloning (LIC) wurde verwendet, um ein RSV bi-cistronic Coexpressionskonstrukt Plasmid herzustellen. LIC ist eine in den frühen 1990er Jahren entwickelte Methode, die die 3′-5′ Exo-Aktivität der T4-DNA-Polymerase nutzt, um Überhänge mit Komplementarität zwischen dem Vektor und dem DNA-Insert21,22zu erzeugen. Die Konstrukte wurden unter Verwendung der 2BT-10-Vektor-DNA…

Representative Results

Aufreinigung des RNA-freienN0P-ProteinsMit diesem Protokoll kann ein großräumiger löslicher heterodimerer RSV N0P-Komplex erhalten werden. Die volle Länge des N- und N-terminalen Teils der P-Proteine wurde mit 10X His-Tag auf dem N-Protein in E. colico-exprimiert. N0P wurde mit einer Kobaltsäule, Ionenaustausch und Größenausschlusschromatographie gereinigt. N0P enthält sowohl das N- als auch das N-Terminal P in voller Länge, enthielt jedoc…

Discussion

Die bekannten Nukleokapsid-ähnlichen Partikelstrukturen (NCLP) der nicht segmentierten NNS-RNA-Viren (Negative-Sense) zeigen, dass die zusammengesetzten NCLPs das komplexe N mit wirszellulären RNAs sind, wenn sie in bakteriellen oder eukaryotischen Expressionssystemen überexprimiert werden15,16,17,18,19. Frühere Studien haben versucht, das RNA-freie N mit …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Forschungsprogramme im Liang-Labor in Emory werden vom US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), den National Institutes of Health (NIH) unter der Vergabenummer R01GM130950 und dem Research Start-Up Fund der Emory University School of Medicine unterstützt. Der Autor dankt den Mitgliedern des Liang-Labors für hilfreiche Unterstützung und kritische Diskussion.

Materials

Agarose SIgma A9539-500G making construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore UFC901024 concentrate the protein sample
Ampicillin sodium GOLD BIOTECHNOLOGY 5118.111317A antibiotic for cell culture
AseI NEB R0526S making construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose Beads Gold Bio H-310-500 For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath Heater CORNING 6885-DB Heate the sample
dCTP Invitrogen 10217016 making construct using LIC method
dGTP Invitrogen 10218014 making construct using LIC method
Glycerol Sigma G5516-4L making solution
HEPES Sigma H3375-100G making solution
HiTrap Q HP Sigma GE29-0513-25 Protein purification
Imidazole Sigma I5513-100G making solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) GOLD BIOTECHNOLOGY 1116.071717A induce the expression of protein
Microcentrifuge Tubes VWR 47730-598 for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor SpectraLab MSX-XL-2020 sonicator for lysing cell
Negative stain grids Electron Microscopy Sciences CF400-Cu-TH For making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44R eppendorf M1282-0000 Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 Substitute Sigma 74385-1L making solution
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480L PCR
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28706 Purify DNA
SSPI-HF NEB R3132S making construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GL Sigma GE29-0915-96 Protein purification
T4 DNA polymerase Sigma 70099-3 making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge Fisher Scientific 36-101-0816 Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochloride Sigma T3253-250G making solution
Uranyl Formate Electron Microscopy Sciences 22451 making negative stain solution

Referencias

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Gao, Y., Ogilvie, C., Raghavan, A., Von Hoffmann, C., Liang, B. Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus. J. Vis. Exp. (173), e62010, doi:10.3791/62010 (2021).

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