JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

CRISPR/Cas9 تحرير الجين C. elegans rbm-3.2 باستخدام علامة فحص dpy-10 Co-CRISPR ومجمعات ريبونوكليوبروتين المجمعة.

Published: December 11, 2020
doi:
10.3791/62001
, , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,The University of Tulsa

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو تمكين تحرير CRISPR/Cas9 السلس لجينوم C. elegans باستخدام مجمعات ريبونوكليوبروتين المجمعة وعلامة dpy-10 المشتركة CRISPR للفحص. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء مجموعة متنوعة من التعديلات الجينية في C. elegans بما في ذلك عمليات الإدراج والحذف واستبدال الجينات واستبدال الكودون.

Abstract

البكتيرية متفاوتة بانتظام قصيرة Palindromic تكرار (CRISPR)/العقدية pyogenes CRISPR المرتبطة البروتين (كاس) النظام قد سخرت من قبل الباحثين لدراسة المشاكل الهامة ذات الصلة بيولوجيا. تسمح القوة التي لا مثيل لها لطريقة تحرير الجينوم CRISPR/Cas للباحثين بتحرير أي مكان يختارونه بدقة ، وبالتالي تسهيل زيادة فهم وظيفة الجينات. وقد وصفت عدة طرق لتحرير الجينوم C. elegans بواسطة CRISPR/Cas9 سابقا. هنا، نناقش ونوضح طريقة تستخدم في مجمعات ريبونوكليوبروتين المجمعة في المختبر وعلامة dpy-10 المشتركة CRISPR للفحص. على وجه التحديد ، في هذه المقالة ، نذهب من خلال عملية خطوة بخطوة لإدخال codons وقف سابق لأوانه في الجين C. elegans rbm-3.2 عن طريق إصلاح موجهة homology باستخدام هذه الطريقة من تحرير CRISPR / Cas9. يمكن استخدام طريقة التحرير البسيطة نسبيا لدراسة وظيفة أي جين ذي أهمية وتسمح بتوليد تحرير C. elegans بواسطة CRISPR/Cas9 في أقل من أسبوعين.

Introduction

الكتلة بانتظام بين متباعدة قصيرة Palindromic تكرار (CRISPR)/ المكورات العقدية pyogenes كريسبر المرتبطة البروتين (كاس) التكنولوجيا تمكن كفاءة تحرير الجينوم المستهدفة في مجموعة واسعة من الكائنات الحية1،2،3،4. تم اكتشاف نظام CRISPR لأول مرة كجزء من الاستجابة المناعية المضادة للفيروسات prokaryotic5،6،7. يستخدم نظام CRISPR TYPE II اندونوكليس مثل Cas9، A RNA تنشيط (tracrRNA) وقصيرة, الهدف الحمض النووي محددة 20-nucleotide دليل طويل CRISPR RNA (crRNA) للتعرف على “NGG” Protospacer المجاور Motif (PAM) وجعل كسر مزدوج تقطعت بهم السبل في الحمض النووي الهدف5,6,7,8,9,10,11,12. يتم التعرف على هذه الاستراحة المزدوجة كآفة من خلال آلات إصلاح الحمض النووي الخلوية. وبالتالي ، يمكن إصلاح كسر مزدوجة تقطعت بهم السبل التي تم إنشاؤها عن طريق واحد من مسارين – 1) غير متجانسة نهاية الانضمام (NHEJ) أو ii) إصلاح موجهة Homology (HDR)13. NHEJ غالبا ما يكون عرضة للخطأ، وبالتالي، عندما يتم استخدام هذا المسار لإصلاح كسر مزدوجة تقطعت بهم السبل في الحمض النووي الهدف، فإنه غالبا ما يسبب الطفرات المعطل (الإدراج، والحذف) في الجين من الفائدة. من ناحية أخرى ، من خلال توفير قالب إصلاح خارجي مع homology إلى جانبي كسر مزدوج حبلا ، يمكن توجيه آلات إصلاح الحمض النووي الخلوية لاستخدام HDR لإصلاح كسر13. وهكذا تمكن طريقة HDR من التحرير الدقيق لأي مكان اهتمام.

وقد وصفت مجموعة متنوعة من بروتوكولات تحرير الجينات CRISPR/Cas9 لC. elegans14،15،16،17،18،19،20. الأكثر استخداما CRISPR /Cas9 طرق التحرير في C. elegans تشمل كل من الاستنساخ القائم على وبروتوكولات خالية من الاستنساخ لتوليد قوالب إصلاح ل CRISPR / Cas9 التحرير14،15،16،17،18،19،20. يناقش هذا البروتوكول بالتفصيل بروتوكول تحرير CRISPR/Cas9 الخالي من الاستنساخ استنادا إلى استخدام dpy-10 كعلامة CRISPR مشتركة للفحص. حتى الآن ، فإن C. elegansالمفصلة الوحيدة التي تركز على CRISPR / Cas9 تحرير بروتوكول الفيديو الموجود يستخدم علامة الفلورسنت لفحص21. ومع ذلك ، فإن استخدام علامة الفلورسنت للفحص يتطلب الوصول إلى مجهر مضان ، والذي قد تجد العديد من المختبرات في المؤسسات الجامعية الصغيرة (PUIs) صعوبة في الوصول إليه. ومن المشجع أن نلاحظ أنه تم الحصول على نتائج إيجابية مترابطة في الدراسات السابقة بين الديدان التي تحمل علامات الفلورسنت ووجود تحرير21،22. ومع ذلك، من الضروري إجراء دراسات إضافية لتحديد الكفاءة الإجمالية لطريقة الفحص القائمة على الفلورسينس لتحرير مجموعة واسعة من loci مع RNAs دليل مختلف وقوالب الإصلاح. وأخيرا ، منذ ترميز البلازميدات لهذه العلامات الفلورية تشكل صفائف خارج الكروموسومات ، وغالبا ما تنتج مضان متغير من هذه الصفائف التي يمكن أن تجعل من الصعب تحديدايجابيات 23. ومن ثم، وعلى الرغم من أن طريقة الفرز القائمة على الفلورسينس قد تكون مفيدة لاعتمادها، فإن المسائل المذكورة أعلاه قد تحد من قابليتها للتطبيق.

باستخدام علامة كريسبر المشتركة التي تنتج النمط الظاهري مرئية يقلل كثيرا من عدد ذرية التي تحتاج إلى فحص للعثور على دودة تحريرها بشكل إيجابي23،24،25،26،27،28. الأهم من ذلك، يمكن الكشف عن الأنماط الظاهرية التي تنتجها هذه العلامات بسهولة تحت المجهر تشريح بسيط23،24،25،26،27،28،29،30،31،32،33،34. علامة dpy-10 المشترك CRISPR هي واحدة من أفضل العلامات المميزة والمستعملة على نطاق واسع شارك CRISPR لأداء C. elegans CRISPR / Cas9 تحرير الجينوم24،27. لذلك، ستناقش هذه المقالة طريقة تنفيذ CRISPR/Cas9 التحرير في C. elegans باستخدام التسليم المباشر للمجمعات ريبونوكليوبروتين مع dpy-10 كعلامة كريسبر المشارك27،35. في هذه الطريقة، ومزيج حقن التحرير المعدة يتكون من نمط إصلاح dpy-10 dpy-10 تتميز جيدا والقالب dpy-10 إصلاح للتوسط في توليد المهيمنة ملحوظ “الأسطوانة” (رول) النمط الظاهري الذي يمنحه هوتيروزيغوس dpy-10(cn64) طفرة المعروفة داخل الجين dpy-10 24،27،29. عندما تكون موجودة في حالتها homozygous، الطفرة dpy-10 (cn64) يسبب النمط الظاهري مزبل (Dpy) التي تنتج أقصر والديدان stouter24،29. يتم التوسط في النمط الظاهري رول عن طريق الإدراج الدقيق للقالب dpy-10 إصلاح الموردة المشتركة في نسخة واحدة من الجين dpy-10 بواسطة HDR بوساطة CRISPR / Cas9 التحرير. لذلك ، يشير ظهور Rol C. elegans إلى حقن ناجح بالإضافة إلى حدث تحرير ناجح بوساطة HDR داخل خلايا الدودة المحقونة. منذ crRNA وقالب إصلاح الجين المستهدف من الفائدة هي في نفس مزيج الحقن مع dpy-10 crRNA و dpy-10 قالب الإصلاح، وهناك فرصة جيدة أن الديدان رول المحددة كما تم تحريرها في وقت واحد في الجين المستهدف من الفائدة. ومن ثم، يتم فحص هذه الديدان رول لتحرير الاهتمام من قبل تقنيات مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (للتحريرات أكبر من 50 نقطة أساس) أو عن طريق PCR تليها تقييد الهضم (للتحرير أقل من 50 نقطة أساس).

مزايا استخدام هذه الطريقة لتحرير الجينوم هي: 1) يمكن إنشاء تعديلات CRISPR بكفاءة عالية نسبيا (2٪ إلى 70٪) باستخدام هذه الطريقة27؛ ‘2’ لا تنطوي قوالب الإصلاح وتوجيه الرناس المستخدمة في هذه الطريقة على الاستنساخ، مما يقلل من الوقت اللازم لتوليدها؛ 3) عن طريق تجميع مجمعات ريبونوكليوبروتين في المختبر، يمكن الحفاظ على تركيزات مجمعات التحرير المجمعة ثابتة نسبيا ، وبالتالي تحسين القابلية للاستنساخ ؛ 4) وقد ثبت بعض RNAs دليل التي تفشل في توليد تعديلات عندما أعرب من البلازميدات للعمل ل CRISPR / Cas9 تحرير الجينوم عندما زودت كما في المختبر crRNAs منقول27؛ v) بما في ذلك علامة dpy-10 المشتركة CRISPR تمكن من الفحص السهل باستخدام المجهر تشريح ويقلل من عدد ذرية التي يجب فحصها للعثور على ايجابيات24،27؛ و vi) تسلسل الحمض النووي التحقق من خطوط دودة homozygous تحريرها يمكن الحصول عليها بهذه الطريقة في غضون بضعة أسابيع19،27.

وقد نشرت فصول الكتاب ممتازة تتعلق العديد من مختلف أساليب كريسبر C. elegans 14،15،16،17،18،19،20،43. ومع ذلك ، فإن عرض طريقة dpy-10 المشتركة CRISPR في شكل فيديو في إعداد المختبر غير موجود حاليا. في هذه المقالة، ونحن نصف ونوضح عملية استخدام dpy-10 طريقة كريسبر المشترك لتحرير جين الهدف التمثيلي اسمه rbm-3.2، وهو بروتين المفترضة الحمض النووي الريبي ملزمة (WormBase:https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10).  على وجه التحديد، هنا نصف بالتفصيل طريقة إدخال ثلاثة codons وقف سابق لأوانه داخل الجين C. elegans rbm-3.2 باستخدام في المختبر تجميعها مجمعات ريبونوكليوبروتين وقالب إصلاح خطي خارجي واحد تقطعت بهم السبل. وقد نجحت هذه الدراسات في توليد أول سلالة C. elegans CRISPR مع codons توقف سابق لأوانه في الجين rbm-3.2. وبما أنه لا يعرف الكثير حاليا فيما يتعلق بوظيفة هذا الجين في سي إليغانس، فإن هذه السلالة ستكون بمثابة أداة مفيدة في تشريح وظيفة RMB-3.2. ويمكن أيضا اعتماد هذه الطريقة لإجراء عمليات الإدراج والتبديل والحذف في أي مكان داخل الجينوم C. elegans.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول لتحرير الجينوم CRISPR/Cas9 من قبل لجنة السلامة الحيوية المؤسسية بجامعة تولسا باتباع إرشادات المعاهد القومية للصحة. في جميع أنحاء هذا البروتوكول، تم ممارسة تقنية معقمة. وقد نفذت جميع خطوات هذا البروتوكول باستخدام الكواشف الخالية من النوى. وقد تم اتخاذ عناية خاصة لمنع تلوث RNase مثل قفازات التنظيف وكذلك مساحات العمل والمعدات (مثل المصايب ، السطح الخارجي للأواني الزجاجية ، وما إلى ذلك) مع محلول إزالة التلوث RNase. 1. تصميم كرنا ابحث عن PAM التي تمكن Cas9 من القطع الأقرب إلى موقع التحرير. موقع PAM هو 5′-NGG-3′. تذكر أن PAM يمكن أن يكون على أي حبلا من الحمض النووي. حدد 20 نقطة أساس في نهاية 5 ‘من PAM والتسلسل crRNA.ملاحظة: تسلسل crRNA الفعلي الذي يتم توليفه من قبل الشركات التجارية أطول من 20 نقطة أساس كما يحتوي على تسلسل عام إضافية التي يتم إضافتها تلقائيا إلى تسلسل 20 bp crRNA الخاصة الهدف بواسطة شركة توليف. وفيما يتعلق بالآثار خارج الهدف، لم تجد الدراسات الحديثة آثار خارج الهدف من Cas9 في C. elegans36،37،38،39،40. علاوة على ذلك ، يتم تجاوز السلالات الناتجة عن تحرير CRISPR. ولذلك، فإننا لا نشعر بقلق بالغ إزاء الآثار غير المستهدفة للكرناس المصممة. ومع ذلك، يمكن استخدام المواقع على الانترنت بما في ذلك http://genome.sfu.ca/crispr/ http://crispor.tefor.net/ للعثور على واختيار crRNAs مع آثار أقل خارج الهدف38،41. crRNAs التي تنتهي مع G أو GG وتلك التي لديها أكثر من 50٪ GC-المحتوى ومن المتوقع أن تكون أكثر كفاءة19،23،42. اطلب ما لا يقل عن 10 نانومول من الكرنا من شركة (مثل IDT و Horizon Discovery وما إلى ذلك). بمجرد وصول crRNA lyophilized ، قم بتخزينه عند -30 درجة مئوية حتى يوم الميكروينيكشن. في يوم تنفيذ microinjection، تدور crRNA lyophilized بأقصى سرعة (17،000 × ز) لمدة دقيقة واحدة وإعادة إنفاقه في 5 MM تريس-Cl (درجة الحموضة 7.4) لجعل 8 ميكروغرام / ميكرولتر الأسهم من CRRNA. تخزين المخزون crRNA غير المستخدمة المجمدة في -80 درجة مئوية. 2. إصلاح تصميم قالب تحميل برنامج معالجة تسلسل (مثل عارض تسلسل CLC، APE، Snapgene، ناقلات NTI، الخ). نحن نستخدم CLC تسلسل المشاهد الإصدار 8.0 (Qiagen) كما هو سهل الاستخدام ويمكن تحميلها مجانا. لصق تسلسل الحمض النووي الهدف من الفائدة في المشاهد تسلسل. يؤثر اتجاه قالب الإصلاح على كفاءة التحرير28. لإدراج تسلسل إصلاح إلى نهاية 5 ‘من PAM، تصميم قالب إصلاح واحد تقطعت بهم السبل مع تسلسل الحمض النووي من حبلا الحمض النووي نفسه الذي يقع تسلسل PAM (حبلا protospacer)28. بينما لإدراج تسلسل إصلاح إلى نهاية 3 ‘من PAM، تصميم قالب إصلاح واحد تقطعت بهم السبل مع تسلسل الحمض النووي من حبلا الحمض النووي التي لا تحمل تسلسل PAM (حبلا فاصل)28. حدد 35 زوجا أساسيا من التسلسل مع التماثل دون انقطاع على كلا الجانبين (في نهاية 5 و 3’ من التحرير. قم بتكوير أو حذف PAM لمنع قطع قالب الإصلاح أو الحمض النووي الجينومي المحرر بواسطة Cas9. إذا لم يكن من الممكن حدوث طفرة في PAM ، فادخل العديد من الطفرات الصامتة القريبة من نهاية 5 من PAM لمنع قطع قالب الإصلاح أو الحمض النووي الجينومي المحرر. تأكد من إدخال الطفرات الصامتة فقط من PAM إذا كان موجودا في منطقة exonic. تحقق من تردد استخدام كودون للتأكد من أن يتم إدخال كودون تحور على تردد مماثل لكودون الأصلي غير تحور (على سبيل المثال https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). في بعض الحالات، قد لا يكون من الممكن إدخال كودون تحور على وتيرة مماثلة لكودون غير المبادلة. ومع ذلك ، لصنع طفرات من عدد قليل من الأحماض الأمينية ، لا نتوقع أن يتغير مستوى التعبير عن البروتين المتحول بشكل كبير. إذا كان التعديل صغيرا (مثل طفرة في عدد قليل من القواعد) ، فادخل موقعا فريدا للقيود قريبا من التحرير عن طريق تكوين صامت. نحن نستخدم http://heimanlab.com/cut2.html للعثور على مواقع تقييد يمكن إدخالها عن طريق تكوين صامت. تحقق من تردد استخدام كودون للتأكد من أن يتم إدخال كودون تحور على تردد مماثل لكودون الأصلي غير تحور. وكما ذكر أعلاه، فإن هذا ليس ممكنا دائما. ومع ذلك ، للتجارب التي تنطوي على طفرات من عدد قليل من الأحماض الأمينية ، ونحن لا نتوقع مستوى التعبير عن البروتين متحولة أن تتغير بشكل كبير. توليف وشراء الخطية واحد تقطعت بهم السبل إصلاح قوالب HDR كما 4 nmol ultramer oligos. Resuspend قالب إصلاح oligonucleotide lyophilized في المياه الخالية من النيوكلياز لجعل مخزون 1 ميكروغرام / ميكرولتر من قالب الإصلاح وتخزينه في -30 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. 3. فحص تصميم التمهيدي باستخدام عارض تسلسل CLC أو تطبيقات أخرى مشابهة، قم بتصميم 20 إلى 23 زوجا أساسيا للأمام وعكس المبرمجين على جانبي التحرير على التوالي، بحيث تنتج نطاق يتراوح بين 400 إلى 600 زوج أساسي عند تضخيم PCR. للإدراج أكبر التي هي عدة كيلوbases في الحجم، تصميم التمهيدي الأمامية أن يكون موجودا خارج الذراع homology الأيسر من قالب الإصلاح. تصميم التمهيدي العكسي أن يكون موجودا داخل قالب الإصلاح نفسه. في هذه الحالة، سيتم الحصول على منتج PCR فقط في حالة الديدان المحررة بشكل إيجابي. لتعريف worms تحرير homozygous للإدراج أطول تكبير المنطقة بأكملها من الإدراج عن طريق تصميم التمهيديات إلى الأمام وعكس التي تقع خارج تقاطعات الإدراج. اختبار التمهيديات وتحسين ظروف PCR مع الحمض النووي الجينومي البرية من نوع قبل استخدام التمهيديات ل genotyping. تأكد من إنتاج نطاق واحد من الحجم المتوقع عند تضخيم PCR للحمض النووي الجينومي (عند الاقتضاء). 4. إعداد الديدان البالغة الشباب للحقن اختيار L2-L3 المرحلة C. elegans على العشب البكتيري الطازج على لوحة MYOB واحتضان في 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.ملاحظة: يمكن العثور على البروتوكول الخاص بصنع لوحات MYOB هنا: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/ في يوم الحقن المجهري، اختر الديدان البالغة الصغيرة التي بها أقل من 10 أجنة في الرحم لحقنها. 5. إعداد مزيج الحقن إعداد مزيج الحقن بنفس الترتيب كما هو مبين في الجدول 1 في أنابيب خالية من النيوكليز العقيمة.ملاحظة: يمكن تقليص مكونات مزيج الحقن لجعل 5 ميكرولتر حقن يمزج (بدلا من 20 ميكرولتر) إذا لم تكن متوقعة الحقن في المستقبل مع هذا المزيج. مزيج من مزيج الحقن عن طريق الأنابيب. احتضان مزيج الحقن في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتجميع مجمعات ريبونوكليوبروتين. تدور مزيج الحقن في 4 درجة مئوية في 17،000 × ز لمدة 5 دقائق. 6. الميكرويكشن في C. elegans النعود إجراء حقنة دقيقة من مزيج حقن CRISPR في C. elegans gonad، كما هو موضح في Iyer et al. 201943. حقن حوالي 30 الديدان مع مزيج حقن CRISPR. يمكن إعادة استخدام مزيج الحقن غير المستخدم عن طريق التخزين عند 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر دون فقدان الكفاءة49. حقن كل من الأسلحة النند إذا كان ذلك ممكنا. تعتبر الديدان المحقونة جيل P0. 7. حقن استعادة الدودة ونقلها بعد الميكرويينجيكت، نقل الديدان P0 microinjected باستخدام دودة اختيار إلى لوحة أجار MYOB 60 ملم بذر مع OP50 E. القولونية والسماح لهم بالتعافي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة تقريبا. لاحظ أن درجة حرارة الانتعاش ستعتمد على النمط الجيني للديدان المحقونة. على سبيل المثال، بالنسبة للسلالات الحساسة لدرجة الحرارة، قد يكون من الضروري استعادة الدودة عند درجة حرارة مختلفة. باستخدام اختيار دودة الأسلاك البلاتينية، نقل كل دودة حقن على لوحة واحدة بذر 35 ملم MYOB أغار بيتري والسماح لهم لوضع البيض في 20 درجة مئوية حتى اليوم التالي. لاحظ أن بعض الديدان ستموت نتيجة للإصابة الناجمة عن إجراء التجميل الدقيق. فقط اختيار تلك الديدان التي هي على قيد الحياة وتظهر الحركة. بعد 24 ساعة، نقل الديدان المحقونة إلى لوحات فردية جديدة (دودة واحدة لكل لوحة). 8. اختيار C. elegans للفحص 3 إلى 4 أيام في 20 درجة مئوية بعد إجراء الحقن، ورصد جميع اللوحات التي تحتوي على ذرية من الديدان حقن باستخدام المجهر تشريح. تحديد اللوحات التي لديها F1 ذرية عرض الأسطوانة (رول) وزبل (Dpy) الأنماط الظاهرية. النمط الظاهري Dpy هو المكان الذي تظهر فيه الديدان أقصر وstouter من الديدان السيطرة في نفس المرحلة التنموية (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0–10). لوحات مع الديدان رول و Dpy تمثل لوحات حيث تم تحريرها بنجاح ذرية F1 مع طفرة dpy-10 (cn64) لتكون موجودة في حالة heterozygous أو homozygous، على التوالي. اختيار لوحات مع معظم الديدان الدوارة وملتقلبة للفحص. واحد من أصل 50 إلى 100 F1 رول الديدان من هذه الصفائح إلى لوحات الفردية الخاصة بهم (1 دودة لكل لوحة) والسماح لهم لوضع البيض. السماح L4-المرحلية F1 رول الديدان لوضع البيض وإنتاج ذرية (F2) لمدة 1 إلى 2 أيام. 9. تحلل دودة واحدة وPCR بعد إنتاج F2 لمدة 1 إلى 2 أيام, نقل كل واحد F1 رول الأم إلى 2.5 ميكرولتر من العازلة تحلل (الجدول 2) مع تخفيف 1:100 من 20 ملغ / مل بروتيناز K. تجميد الأنابيب في -30 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ويمكن تخزين الديدان في هذه المرحلة لفترة طويلة حتى مزيد من التحليل. قم بإجراء تحلل دودة واحدة على دراجة حرارية PCR مع الشروط التالية: 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، و95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، والاحتفاظ عند 4 درجات مئوية. إضافة الكواشف التالية مباشرة إلى 2.5 ميكرولتر من الدودة المفرغة التي تحتوي على أنبوب PCR: 12.5 ميكرولتر من مزيج ثنائي الفينيل متعدد الكلور يحتوي على dNTPs، بوليمرات الحمض النووي، MgCl2 وصبغ التحميل، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي 10 ميكرومتر، والمياه العقيمة إلى 22.5 ميكرولتر. الحجم الإجمالي لكل تفاعل PCR هو 25 ميكرولتر.ملاحظة: في حالة فحص العديد من الديدان F1، فمن الأسرع والأكثر ملاءمة لجعل PCR الرئيسية مزيج لردود فعل متعددة وإضافة 22.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل أنبوب تحلل. إعداد ردود فعل PCR على thermocycler مع الشروط التالية: 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 35 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 s، 55 درجة مئوية لمدة 15 s (تحسين لكل مجموعة التمهيدي)، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (تحسين لكل الحمض النووي الهدف)44. عقد ردود الفعل في 4 °C. 10. تقييد الهضم وجل الآغاروز الكهربائي ملاحظة: عملية الهضم تقييد ضروري فقط أثناء فحص التعديلات الصغيرة (أقل من 50 نقطة أساس). نقل 10 ميكرولتر من الحمض النووي PCR من الخطوة 9 إلى أنبوب جديد. إضافة ما بين 2 إلى 4 وحدات من تقييد الانزيم و1x تقييد انزيم العازلة (1.5 ميكرولتر من 10x رد فعل العازلة) لكل 15 ميكرولتر رد فعل. احتضان عند 37 درجة مئوية (أو في درجة حرارة أخرى محددة الإنزيم) لمدة 2 ساعة (أقصر أوقات الحضانة قد يكون ممكنا مع الإنزيمات سريعة المفعول). الحرارة تعطيل هضم تقييد عن طريق تسخين أنابيب PCR في 65 درجة مئوية (أو غيرها من درجة حرارة إنزيم محددة) لمدة 10 إلى 15 دقيقة. تحميل رد فعل كامل من كل أنبوب PCR في بئر واحد من هلام agarose 1٪-2٪ وتشغيل هلام في 110 MA حتى يتم تحقيق فصل الفرقة المناسبة.ملاحظة: نستخدم مزيج PCR يحتوي بالفعل على صبغة تحميل مضمنة للتصور أثناء التشغيل على هلام agarose. هذا المزيج لا تتداخل مع رد فعل الهضم تقييد وبالتالي مريحة للاستخدام لفحص العديد من الديدان في وقت واحد. 11. تحديد الديدان المحررة بشكل إيجابي تصور المواد الهلامية agarose تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (لالمواد الهلامية بروميد الإيثيديوم) للكشف عن أحجام الفرقة الحمض النووي.ملاحظة: سوف تعرض الديدان المحررة بشكل إيجابي نطاق إضافي من الحمض النووي بالحجم المتوقع بسبب التحرير باستخدام قالب الإصلاح الذي يحمل موقع التقييد في الموضع المطلوب داخل جينوم الدودة. ومن المتوقع أن تكون الديدان الدوارة F1 heterozygous للتحرير ، وبالتالي من المتوقع أن تظهر ثلاثة نطاقات (منتج واحد من نوع البرية PCR غير المصقول واثنين من شظايا أصغر من المنتج قطع PCR تحريرها). على الرغم من ندرتها ، يجب ملاحظة أن التجانس ينشأ أحيانا. حفظ جميع لوحات الأصلي تحريرها بشكل إيجابي حتى يتم التحقق من وجود تحرير من قبل تسلسل سانجر. 12. تحرير Homozygose من الفائدة اختيار بين 8 و 12 البرية من نوع يبحث غير المتداول F2 الديدان من كل من لوحات دودة F1 رول تحريرها بشكل إيجابي والسماح لهم لوضع البيض وإنتاج ذرية لمدة 1 إلى 2 أيام.ملاحظة: منذ C. elegans هي hermaphrodites التسميد الذاتي، إذا كان أليل تحريرها لا يؤثر على الجدوى أو التنمية، وينبغي أن تكون نسبة المسوخ homozygous المتوقعة حوالي 25٪. يجب أن تكون الديدان F2 غير المتداول البرية من نوع لdy-10 مكان. اختيار الديدان غير المتداول تمكن جيل من الديدان المحررة التي فقدت طفرة dpy-10 (cn64) ويكون فقط طفرة في الجين الخاص بك من الفائدة. لاحظ أن جين dpy-10 موجود على الكروموسوم الثاني. إذا كان جين اهتمامك مرتبطا ب dpy-10، فقد لا تتمكن من فصل طفرة dpy-10 بسهولة بعيدا عن جين اهتمامك. تنفيذ الخطوات 9 من خلال 11 لتحديد خطوط دودة homozygous. 13. تأكيد تحرير حسب التسلسل بمجرد التعرف على الديدان المثلية ، قم بإجراء التحلل وال PCR كما هو موضح في الخطوة 9. إعداد ما لا يقل عن 3 ردود فعل PCR لكل خط homozygous ليتم تسلسلها. تنقية ردود الفعل PCR باستخدام عدة تنقية PCR. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف قطرة النانو. إرسال عينة مع التمهيدي الأمامية المعنية لتسلسل سانجر. تأكد من أن التمهيدي الأمامي مصمم ليكون على الأقل 50 قاعدة بعيدا عن التحرير ليتم تسلسله. تحليل نتائج التسلسل باستخدام برنامج تحليل التسلسل لتأكيد وجود التحرير.

Representative Results

rbm-3.2 هو بروتين المفترضة الحمض النووي الريبي ملزمة التي لديها homology إلى عامل التحفيز الانقسام البشري subunit 2 متغير تاو (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). تم تحديد البروتين RBM-3.2 كشريك ملزم للبروتين فوسفاتاز 1 (GSP-1) والمنظمين المانع-2 (I-2SZY-2)وSDS-22 في دراسة سابقة حددت هذه البروتينات كمنظمين جديدة لازدواجية C. elegans centriole (البيانات غير المعروضة)45. في الوقت الحاضر ، لا يعرف سوى القليل جدا فيما يتعلق بوظيفة الجين rbm-3.2 في C. elegans. وبالتالي، لمزيد من التحقيق في الدور البيولوجي للجين C. elegans rbm-3.2، تم الحصول على rbm-3.2-خالية أليل rbm-3.2 (ok688) من مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC). لسوء الحظ ، بالإضافة إلى امتلاك حذف كامل RBM – 3.2 الجين ، وrbm – 3.2 (ok688) أليل يؤدي أيضا إلى حذف جزئي للجين المتداخلة ، rbm – 3.1 ، مما يعقد التحليل الجيني. لذلك ، من أجل التحقيق بدقة في دور الجين rbm-3.2 في C. elegans ، استخدمنا CRISPR / Cas9 التحرير لإدخال ثلاثة codons توقف سابق لأوانه قريبة جدا من بداية C. elegans rbm-3.2 منطقة الترميز ، وترك تداخل rbm-3.1 الجينات سليمة. لإدخال هذه codons وقف سابق لأوانه في الجين C. elegans rbm-3.2، صممنا crRNA مع عزر PAM التي كانت تقع على حبلا المعاكس (حبلا قالب) من الحمض النووي (الشكل 1A). وكان موقع قطع Cas9 تقع 6 قواعد بعيدا عن RBM-3.2 بدء كودون ATG. لإدخال كودونات التوقف المبكر في الجين RBM-3.2، صممنا قالب إصلاح مع الخصائص الرئيسية الخمس التالية: 1) 35 قواعد من الأوهام دون انقطاع إلى rbm-3.2 المنبع من rbm-3.2 بدء كودون (الذراع التماثل الأيسر) 2) تم حذف امتداد قصيرة من القواعد التي تحتوي على عزر PAM 3) تم إدخال موقع تقييد EcoRI مباشرة بعد بدء codon للفحص 4) تم حذف codons الثاني والثالث من RBM-3.2 و وقدم ثلاثة codons وقف بعد الخامس RBM-3.2 codon لوقف ترجمة RBM-3.2 مرنا 5) 35 تم تضمين قواعد التماثل دون انقطاع إلى intron الأول من rbm-3.2 المصب من تحرير (الذراع homology الحق) ( الشكل1B). تم إعداد مزيج الحقن لهذه التجربة CRISPR كما هو مبين في الجدول I. تم احتضان مزيج الحقن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتجميع مجمعات ريبونوكليوبروتين. ثم تم طرد المزيج وتحميله في إبرة الحقن المجهري التي تم سحبها. تم تنفيذ الميكرويكشن في C. elegans gonad كما هو موضح في Iyer et al. 201943. يصور الشكل 2 الجدول الزمني التجريبي لإنشاء تحرير C. elegans باستخدام هذا البروتوكول. على الرغم من أننا عادة ما حقن 30 الديدان لكل تجربة CRISPR، بعض المختبرات حقن عدد أقل من الديدان (بين 10 إلى 20) لكل تجربة كريسبر. وبما أن حقن المزيد من الديدان يزيد من احتمال العثور على تعديلات إيجابية ، فإننا نفضل حقن عدد أكبر من الديدان. العديد من المختبرات اختيار “الفوز بالجائزة الكبرى” الحضنات (لوحات مع أكبر من 50٪ رول و Dpy ذرية) للفحص. في تجربتنا بعد إجراء العديد من التجارب CRISPR، على الرغم من أن الحضنات الفوز بالجائزة الكبرى لا تنشأ في بعض الأحيان، في معظم الأحيان، والديدان رول التي يتم انتقاؤها للفحص غالبا ما تأتي من العديد من لوحات P0 مختلفة، كل تتكون من عدد قليل من ذرية رول. لم يتم الحصول على أي حضن الفوز بالجائزة الكبرى في هذه التجربة. في المجموع ، فحصنا الحمض النووي الجينومي ل 73 دودة F1 Rol التي تم الحصول عليها من 7 ديدان P0 تم حقنها لوجود التحرير. يتم تمثيل تسلسل التمهيديات الفرز ومواقعها فيما يتعلق codon بداية من الجين RBM-3.2 في الشكل 3A. من خلال تحليلنا ، تم العثور على 7 من أصل 73 F1 الديدان لتكون إيجابية لتحرير (9.5 ٪) ( الشكل3B). الديدان غير المضاءة عرض جزء واحد من الحمض النووي من 445 نقطة أساس على هضم EcoRI. في حين أن الديدان التي تحمل كودون توقف سابق لأوانه في الجين rbm-3.2 أظهرت جزأين من 265 نقطة أساس و 166 نقطة أساس على التوالي عند هضم EcoRI. عرضت الديدان المحررة من Heterozygous ثلاث شظايا على عملية الهضم EcoRI: جزء حمض نووي واحد غير منقح من النوع البري يبلغ 445 نقطة أساس وجزأين من الحمض النووي من 265 bp و 166 bp على التوالي من النسخة المحررة من الجين rbm-3.2. لتحديد الديدان التي تحمل تعديلات homozygous ، نقلنا 12 ديدان F2 من الهتروزيغوتات F1 الإيجابية المحددة على لوحات فردية جديدة وسمحنا لهم بإنتاج ذرية (F3). ثم تم فحص الديدان F2 للتجانس كما هو موضح سابقا. 6 من أصل 12 (50٪) تم العثور على الديدان التي تم فحصها لتكون homozygous لتحرير اهتمامنا (الشكل 4A). تم استخدام الحمض النووي الجينومي لخط دودة تم تحريره بشكل متجانس لإعداد رد فعل تسلسل الحمض النووي. أكد تحليل تسلسل الحمض النووي وجود التحرير في حالته المثلية (الشكل 4B). بشكل عام، من المفيد تسلسل خطوط دودة متجانسة متعددة لضمان أن جميع خطوط الديدان المحررة بشكل متجانس تظهر نفس النمط الظاهري (إذا كانت الطفرة الخالية تنتج نمطا فينونمطي معين). علاوة على ذلك ، قد يكون من الضروري أيضا التحقق من صحة الضربات القاضية الجينية باستخدام المقايسة المستندة إلى التعبير مثل النشاف الغربي أو RT-PCR أو عن طريق تحليل النمط الظاهري. وذلك لأنه، فمن الممكن أنه على الرغم من إدخال codons وقف قبل الأوان في بداية الجين، قد يكون هناك ATG بديل المصب من codons توقف سابق لأوانه. يمكن استخدام هذا ATG لبدء التعبير عن البروتين ، مما يؤدي إلى بروتين مبتور وظيفي جزئيا. الكاشف تركيز وحدة التخزين إلى إضافة Cas9 البروتين في المياه الخالية من النيوكليز مع 20٪ الجلسرين 2 ميكروغرام/ميكرولتر 5 ميكرولتر tracrRNA في 5 م م تريس-Cl PH 7.5 4 ميكروغرام/ميكرولتر 5 ميكرولتر dpy-10 crRNA في 5 م م تريس كل pH 7.5 8 ميكروغرام/ميكرولتر 0.4 ميكرولتر rbm-3.2 crRNA في 5 م م تريس-Cl pH 7.5 8 ميكروغرام/ميكرولتر 1 ميكرولتر dpy-10 قالب إصلاح في المياه الخالية من النيوكليز العقيمة 500 نانوغرام/ميكرولتر 0.55 ميكرولتر rbm-3.2 إصلاح قالب في المياه الخالية من النيوكليز العقيمة 1 ميكروغرام/ميكرولتر 2.2 ميكرولتر KCl في مياه خالية من النيوكليز العقيم 1 م 0.5 ميكرولتر مياه خالية من النيوكليز العقيم – 5.35 ميكرولتر الجدول 1: مكونات مزيج الحقن لتحرير CRISPR/Cas9 باستخدام مجمعات ريبونوكليوبروتين و dpy-10 كعلامة CRISPR مشتركة. استخدام تقنيات معقمة و الكواشف خالية من RNase أثناء صنع مزيج الحقن. يرجى ملاحظة أنه تم استخدام المياه المعقمة غير المعالجة من النيوكلياز غير المعالجة لصنع مزيج الحقن. الكاشف تركيز وحدة التخزين التي يجب إضافتها KCl 1 م 5 مل ثلاثيات-HCl pH 8.3 1 م 1 مل MgCl2 1 م 250 ميكرولتر NP-40 (أو IGEPAL CA-630) 100% 450 ميكرولتر توين-20 100% 450 ميكرولتر الجيلاتين 2% 500 ميكرولتر الماء – 92.35 مل الجدول 2: وصفة العازلة تحلل دودة. يمكن إجراء العازلة تحلل دودة بكميات كبيرة، autoclaved، تصفيتها وaliquoted للتخزين على المدى الطويل (ملاحظة: يمكن تخزين المخزن المؤقت تحلل لأكثر من عام في درجة حرارة الغرفة). إضافة تخفيف 1:100 من 20 ملغ / مل بروتيناز K إلى العازلة تحلل دودة قبل كل استخدام. الشكل 1: التخطيطي تظهر crRNA وتصميم قالب إصلاح لrbm-3.2 وقف سابق لأوانه CRISPR. A.التخطيطي عرض الترميز وخيوط قالب من الجين RBM-3.2 مع تسلسل crRNA وتسلسل عزر PAM تقع على حبلا القالب. B.التخطيطي تمثل خصائص مختلفة من قالب الإصلاح الذي تم توليفه لإدخال ثلاثة codons وقف سابق لأوانه في الجين RBM-3.2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: الجدول الزمني التجريبي لتوليد homozygous تحريرها C. elegans بواسطة CRISPR / Cas9 التحرير باستخدام مجمعة مسبقا ريبونوكليوبروتين المجمعة و dpy-10 كعلامة كريسبر المشترك. تحليل يوما بعد يوم من الخطوات التي تحتاج إلى القيام بها لتوليد homozygous تحريرها C. elegans باستخدام هذه الطريقة من تحرير CRISPR / Cas9. لفترة وجيزة ، تم حقن 30 دودة بمزيج تحرير CRISPR باستخدام الحقن الدقيق وفصلها على لوحات MYOB الفردية المصنفة مع OP50 E. coli. بعد 24 ساعة ، تم نقل الديدان التي تم حقنها P0 على لوحات MYOB جديدة طازجة وسمح لها بمواصلة وضع البيض. في اليومين 3 و 4 بعد الميكروينيكشن، تم فحص لوحات لوجود الديدان رول F1. تم اختيار لوحات مع الحد الأقصى لعدد الديدان رول و Dpy F1 و 73 F1 رول الديدان (نختار عادة ما بين 50 إلى 100 F1 رول الديدان لكل تجربة CRISPR) وخصت على لوحات MYOB الفردية الجديدة (1 دودة لكل لوحة) وسمح لوضع البيض لمدة 2 يوما تقريبا. في اليوم السادس بعد التجريب الدقيق، تم إعداد lysates دودة من الديدان F1 التي أنتجت ذرية (F2)وتم فحصها لوجود التحرير بواسطة PCR تليها تقييد الهضم مع EcoRI وكهرومورفوريس هلام الآغاروز. في اليوم 7، تم نقل 12 غير رول، غير Dpy F2 الديدان من لوحات إيجابية على لوحات فردية جديدة وسمح لإنتاج ذرية (F3). في اليوم التاسع، تم فحص ديدان F2 للتماثل في التحرير كما هو موضح سابقا. وفي اليوم العاشر، تم إجراء عملية تنظيف تحلل الديدان وال PCR وPCR للديدان المثلية F3 وتم قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف NanoDrop. في اليوم 11، تم إعداد ردود فعل تسلسل سانجر لعينات إيجابية وأرسلت ردود الفعل لتسلسل الحمض النووي. في اليوم الثاني عشر، تم تحليل نتائج التسلسل، وتم التحقق من وجود التحرير باستخدام برنامج تحليل تسلسل (مثل عارض تسلسل CLC). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: فحص لC. elegans التي هي heterozygous لrbm-3.2 توقف قبل الأوان codons. Agarose هلام electrophoresis صور C. elegans الجينوم PCR الحمض النووي هضمها مع EcoRI. تم كتابة 73 دودة F1 الفردية وفحصها للكشف عن وجود تحرير RBM-3.2. تشير الأرقام الحمراء والعلامات النجمية إلى الديدان المحررة بشكل إيجابي. جميع 7 تم تحديدها بشكل إيجابي تحريرها C. elegans كانت heterozygous للتحرير لأنها عرضت واحدة البرية من نوع جزء الحمض النووي غير المحررة من 445 نقطة أساس واثنين من شظايا الحمض النووي من 265 نقطة أساس و 166 نقطة أساس على التوالي من نسخة منقحة من الجين RBM-3.2 على الهضم EcoRI. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: تحديد والتحقق من homozygous تحريرها C. elegans تحمل rbm-3.2 توقف قبل الأوان codons. أ. فحص لC. elegans التي هي homozygous لrbm-3.2 توقف قبل الأوان codons. صور Agarose هلام الكهربائي من الحمض النووي الجينوم C. elegans هضمها مع EcoRI. تم كتابة 12 دودة F2 فردية من لوحات إيجابية وفحصها للتجانس في تحرير rbm-3.2. الأحمر: الديدان المحررة بشكل متجانس. 6 من أصل 12 فحص F2 الديدان (50٪) كانت homozygous لrbm-3.2 توقف قبل الأوان codons. لم يكن هناك منتج PCR للدودة 7. باء – ال 20 في المائ تأكيد إدراج codons وقف سابق لأوانه في rbm-3.2 عن طريق تسلسل الحمض النووي. تخطيطي يظهر مقارنة تسلسل الحمض النووي والبروتين من التجانس غير المحررة والمحررة. أكد تحليل نتائج تسلسل الحمض النووي للحمض النووي الجينومي من الديدان المحررة من homozygous وجود ثلاث ديدان توقف سابقة لأوانها في جين rbm-3.2 عند تحرير CRISPR/Cas9. جميع التغيرات الناتجة عن الأحماض الأمينية بعد تحرير CRISPR/Cas9 يشار إليها إما بالأحرف الحمراء أو النجمة الحمراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

لقد استخدمنا البروتوكول أعلاه لتحرير العديد من الجينات إلى جانب rbm-3.2. وقد تباينت كفاءات التحرير لدينا لمختلف loci، دليل RNAs وقوالب الإصلاح (واحد تقطعت بهم السبل وتقطعت بهم السبل المزدوجة) بين 2٪ و 58٪ (البيانات غير مبين). كفاءات التحرير الملاحظة مماثلة لكفاءات التحرير المبلغ عنها سابقا من 2٪ إلى 70٪ لهذا البروتوكول27. كما نجحنا في استخدام هذه التقنية في إجراء عمليات حذف الجينات. باستخدام اثنين من crRNAs استبدلنا الجين الذي هو قريب من 6 كيلوبايت في الطول مع تسلسل الترميز للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) (البيانات غير المعروضة). لهذه التجربة، تم العثور على حوالي 14٪ من الديدان رول F1 التي تم تحليلها لتكون إيجابية لحذف الجينات واستبدال مع GFP (البيانات غير مبين). ومع ذلك، هناك حاجة إلى تجارب إضافية لتحديد الحد الأقصى لطول عمليات حذف الجينات واستبدالها التي يمكن إجراؤها باستخدام هذه التقنية.

يمكن استخدام هذه التقنية لجعل الإدراجات التي هي حوالي 1.6 كيلو بايت في طول19. وقد أظهرت دراسة حديثة أن لجعل الإدراج التي هي أكثر من 1.6 كيلوبايت في الطول باستخدام هذا البروتوكول، وتوليد اثنين من فواصل حبلا مزدوجة واستخدام قوالب إصلاح مع أذرع أطول homology يمكن تمكين إدراج شظايا أكبر بكثير من الحمض النووي (~ 10 Kb)28. بدلا من ذلك، قد يتم تنفيذ جولات متعددة من تحرير الجينات مع هذا البروتوكول لإنشاء تعديلات أكبر. ويمكن أيضا أن تعتمد غيرها من البلازميد القائم على C. elegans CRISPR / Cas9 بروتوكولات تحرير الجينات لتجارب CRISPR التي تنطوي على إدراج شظايا الحمض النووي أكبر من 1.6 kb46,47,48.

قبل استخدام هذا البروتوكول لتحرير الجينات، من الضروري التأكد من عدم ارتباط جين الاهتمام بالجراد dpy-10 على الكروموسوم الثاني. في حالة ربط جين مستهدف ب dpy-10، قد يكون من الصعب فصل طفرة dpy-10 بعيدا عن تحرير اهتمامك. وبالتالي، في حالة ارتباط جين الاهتمام بالجراد dpy-10، يمكن استخدام علامات CRISPR المشتركة الأخرى مثل unc-58 (X-chromosome) أوunc-22 أو zen-4 (الكروموسوم IV) وبن-1 أو pha-1 (الكروموسوم الثالث) الموجودة على كروموسومات مختلفة24 و25و26و28. البيانات من مختبر ماير تثبت أن بن-1 وزن-4 الطفرات يمكن استخدامها كعلامات CRISPR المشتركة الناجحة للفحص مع هذه الطريقة28. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن استخدام زين-4 وpha-1 كعلامات كريسبر المشاركة يتطلب إجراء تجربة CRISPR في غير البرية من نوع زين-4 (cle10ts) أو pha-1 (e2123ts) الخلفيات على التوالي26،28. وعلاوة على ذلك، قد تتطلب تجارب CRISPR التي تنطوي على بعض علامات CRISPR المشتركة مثل بن-1 إعداد لوحات خاصة (مثل لوحات تحتوي على البنزيميدازول)28. لقد استخدمنا بنجاح علامة UNC-58 co-CRISPR لفحص التعديلات الإيجابية لجين مرتبط ب dpy-10 باستخدام هذه الطريقة (البيانات غير المعروضة). تمنح طفرة unc-58 (e665) نمطا ظاهرا مرئيا (شللا) يمكن استخدامه بفعالية لفحص الديدان المحررة بشكل إيجابي24. بدلا من ذلك، إذا كان الوصول إلى المجهر الفلوري متوفرا، يمكن أيضا استخدام جين gtbp-1 الموسوم بالفلورسنت كعلامة CRISPR مشتركة لهذا البروتوكول19.

من أجل كفاءة تحرير عالية أثناء استخدام هذه الطريقة لتحرير الجينوم ، يجب أن يكون موقع التحرير ضمن 10 إلى 30 قاعدة من موقع القطع Cas9. إذا كان موقع التحرير هو أكثر من 30 قاعدة بعيدا عن موقع القطع Cas9 ، فإن كفاءة التحرير تنخفض بشكل كبير19،35،37. ومع ذلك ، فقد أظهرت دراسة حديثة من مختبر ماير أن إنشاء اثنين من فواصل مزدوجة حبلا على مسافة من بعضها البعض يمكن أن تمكن من إدراج تعديلات بعيدا عن موقع قطع Cas9 باستخدام هذا البروتوكول28.

في البروتوكول الحالي، تم تصميم قالب الإصلاح بحيث تظهر كافة codons التوقف المدرجة الثلاثة في نفس إطار القراءة. ومع ذلك ، فإن استراتيجية بديلة لإنشاء المسوخ فارغة يكون لاستخدام عالمي 43 قاعدة طويلة ضرب في STOP – IN كاسيت التي وصفت سابقا50. الأهم من ذلك، هذا كاسيت لديه codons وقف في جميع إطارات القراءة الثلاثة الممكنة ويسبب الطفرات frameshift. هذه استراتيجية مفيدة بشكل خاص لإنشاء null-mutants عند حدوث إصلاح غير صحيح أو غير كامل في موقع التحرير.

في الختام ، نظرا لقصر مدتها والتقدم الأخير في هذه الطريقة ، وهذه طريقة ممتازة للتجارب المختبرية الروتينية التي تنطوي على إضافة علامات الظهارة المناعية القصيرة ، وعلامات الفلورسنت ، وإجراء حذف الجينات ، واستبدال الجينات واستبدال كودون.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل صناديق بدء جامعة تولسا (TU) وزمالة الصيف لتطوير كلية TU الممنوحة لجيوتي آير. نود أن نشكر برنامج أبحاث الكيمياء الصيفية الجامعية (CSURP) وتحدي أبحاث تولسا الجامعي (TURC) لمنح رواتب للطلاب المشاركين في هذه الدراسة. ونود أن نعترف بالسيدة كارولين دان لمساعدتها التقنية. وأخيرا، نود أن نشكر الدكتورين جوردان وارد وإيمي جاراميلو لامبرت وآنا ألن وروبرت شيف وويليام بوتر وسيلي موغي على تعليقاتهم الناقدة على هذه المخطوطة.

Materials

Barcoded DNA sequencing tubes Eurofins Genomics SimpleSeq Kit Premixed N/A
Cas9 protein PNA Bio CP01 Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C
crRNAs Horizon Discovery/ GE Dharmacon N/A Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
ECoRI New England Biolabs R3101S Stored at -30 °C
Minelute PCR purification kit Qiagen 28004 Spin columns stored at 4 °C
MyTaq Redmix Meridian Bioscience BIO-25043 Stored at -30 °C
Primers IDT N/A Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
Proteinase K Gold Bio P-480-SL4 Stored at -30 °C
Repair template oligos IDT N/A 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
tracrRNA Horizon Discovery/ GE Dharmacon U-002005-50 Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  2. Carroll, D. Genome engineering with targetable nucleases. Annual Review of Biochemistry. 83, 409-439 (2014).
  3. Chandrasegaran, S., Carroll, D. Origins of Programmable Nucleases for Genome Engineering. Journal of Molecular Biology. 428 (5), 963-989 (2016).
  4. Knott, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361 (6405), 866-869 (2018).
  5. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  6. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
  7. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  8. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Almendros, C. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology. 155 (3), 733-740 (2009).
  9. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  10. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
  11. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  12. Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and classification of CRISPR-Cas systems. CRISPR, Methods in Molecular Biology. 1311, 7-75 (2015).
  13. Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
  14. Frøkjær-Jensen, C. Exciting prospects for precise engineering of Caenorhabditis elegans genomes with CRISPR/Cas9. Genética. 195 (3), 635-642 (2013).
  15. Waaijers, S., Boxem, M. Engineering the Caenorhabditis elegans genome with CRISPR/Cas9. Methods. 68 (3), 381-388 (2014).
  16. Xu, S. The application of CRISPR-Cas9 genome editing in Caenorhabditis elegans. Journal of Genetics and Genomics. 42 (8), 413-421 (2015).
  17. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genética. 202 (3), 885-901 (2016).
  18. Nance, J., Frøkjær-Jensen, C. The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox. Genética. 212 (4), 959-990 (2019).
  19. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. 121, 86-93 (2017).
  20. Kim, H. M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in Caenorhabditis elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106 (2019).
  21. Prior, H., MacConnachie, L., Martinez, J. L., Nicholl, G. C., Beg, A. A. A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins. Journal of Visualized Experiments. (134), e57518 (2018).
  22. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly efficient, rapid and Co-CRISPR-independent genome editing in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (11), 3693-3698 (2017).
  23. Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genética. 199 (4), 959-971 (2015).
  24. Arribere, J. A., Bell, R. T., Fu, B. X., Artiles, K. L., Hartman, P. S., Fire, A. Z. Efficient marker-free recovery of custom genetic modifications with CRISPR/Cas9 in Caenorhabditis elegans. Genética. 198 (3), 837-846 (2014).
  25. Kim, H., et al. A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans. Genética. 197 (4), 1069-1080 (2014).
  26. Ward, J. D. Rapid and precise engineering of the Caenorhabditis elegans genome with lethal mutation co-conversion and inactivation of NHEJ repair. Genética. 199 (2), 363-377 (2015).
  27. Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genética. 201 (1), 47-54 (2015).
  28. Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genética. 211 (2), 431-457 (2019).
  29. Levy, A. D., Yang, J., Kramer, J. M. Molecular and genetic analyses of the Caenorhabditis elegans dpy-2 and dpy-10 collagen genes: a variety of molecular alterations affect organismal morphology. Molecular Biology of the Cell. 4 (8), 803-817 (1993).
  30. Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55 (4), 555-565 (1988).
  31. Schnabel, H., Schnabel, R. An organ-specific differentiation gene, pha-1, from Caenorhabditis elegans. Science. 250 (4981), 686-688 (1990).
  32. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Research. 22 (9), 1762-1763 (1994).
  33. Chalfie, M., Thomson, J. N. Structural and functional diversity in the neuronal microtubules of Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 93 (1), 15-23 (1982).
  34. Severson, A. F., Hamill, D. R., Carter, J. C., Schumacher, J., Bowerman, B. The aurora-related kinase AIR-2 recruits ZEN-4/CeMKLP1 to the mitotic spindle at metaphase and is required for cytokinesis. Current Biology. 10 (19), 1162-1171 (2000).
  35. Paix, A., Schmidt, H., Seydoux, G. Cas9-assisted recombineering in C. elegans: genome editing using in vivo assembly of linear DNAs. Nucleic Acids Research. 44 (15), 128 (2016).
  36. Chiu, H., Schwartz, H. T., Antoshechkin, I., Sternberg, P. W. Transgene-free genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas. Genética. 195 (3), 1167-1171 (2013).
  37. Paix, A., et al. Scalable and versatile genome editing using linear DNAs with microhomology to Cas9 Sites in Caenorhabditis elegans. Genética. 198 (4), 1347-1356 (2014).
  38. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  39. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nature Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
  40. Friedland, A. E., Tzur, Y. B., Esvelt, K. M., Colaiácovo, M. P., Church, G. M., Calarco, J. A. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
  41. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  42. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PloS One. 9 (5), e98186 (2014).
  43. Iyer, J., DeVaul, N., Hansen, T., Nebenfuehr, B. Using microinjection to generate genetically modified Caenorhabditis elegans by CRISPR/Cas9 editing. Microinjection, Methods in Molecular Biology. 1874, 431-457 (2019).
  44. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  45. Peel, N., Iyer, J., Naik, A., Dougherty, M. P., Decker, M., O’Connell, K. F. Protein phosphatase 1 down regulates ZYG-1 levels to limit centriole duplication. PLoS Genetics. 13 (1), 1006543 (2017).
  46. Dickinson, D. J., Pani, A. M., Heppert, J. K., Higgins, C. D., Goldstein, B. Streamlined genome engineering with a self-excising drug selection cassette. Genética. 200 (4), 1035-1049 (2015).
  47. Norris, A. D., Kim, H. M., Colaiácovo, M. P., Calarco, J. A. Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans with a toolkit of dual-marker selection cassettes. Genética. 201 (2), 449-458 (2015).
  48. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genética. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  49. Ghanta, K. S., Mello, C. C. Melting dsDNA Donor Molecules Greatly Improves Precision Genome Editing in Caenorhabditis elegans. Genética. 216 (2), (2020).
  50. Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3607-3616 (2018).

Tags

CRISPR/Cas9C. ElegansRbm-3.2 GeneDpy-10 Co-CRISPRRibonucleoprotein ComplexesGenome EditingMicroinjectionRoller PhenotypeDumpy Phenotype

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Smith, A., Bergwell, M., Smith, E., Mathew, D., Iyer, J. CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.. J. Vis. Exp. (166), e62001, doi:10.3791/62001 (2020).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image