成体マウスのデンテート・ジラスにおける全細胞記録と神経再建のための、逆海馬からの急性スライスの作製

実験動物に関するすべての手順は、ドイツ動物福祉法に従い、キール大学の倫理委員会によって承認されました。パルポンドビンクレ(Pvalb-IRES-Cre)マウス23( ジャクソン研究所、リポジトリ番号008069)は、ヘテロ接合コロニーとして維持されたか、またはAi9 Creレポーターマウス24( ジャクソン研究所、リポジトリ番号007909)と交差した。P40-P90の間に雌マウスと雄マウスを用いた。マウスは、標準的なグループの収容条件下で12時間の明暗サイクルで維持され、食物および水 のアドリビタムを提供された。 1. ソリューションの準備 注:超純水(UPW)(25°C 18.2 MΩcmの抵抗率)を使用して、実験日ごとに新鮮なソリューションを準備してください。この溶液は、最大1日4°Cで保存することができます。マグネシウムおよびカルシウム溶液は、1 Mストック溶液として別々に保存することができます。すべての作業ソリューションは、使用前および使用中に最適な酸素化およびpH維持のためにカルボーゲン(95%O2:5%CO2)で飽和する必要があります。 切断液(マウス1個あたり500 mL)(mM単位):92 NMDG、2.5 KCl、 1.25 NaH2PO4,30NaHCO3,20HEPES,25グルコース,5ナアスコルビン酸,4ナピルビン酸塩,0.5 CaCl2·2H2O,および10 MgSO47H2O. TitrateをpH 7.4に3.4%塩酸付加前にpH 7.4これにより MgSO4の沈殿を回避できます。注:KClおよびNaH2PO4 は4°Cの10xの解決として貯えることができる。 我々は、切断溶液の2つの個々のバッチを作ります。1つは、録音の前日(砕いた氷を生成するために一晩冷凍庫に保存されている)と記録の日に1つ。 ストレージソリューション(マウスあたり250 mL)(mM単位):92 NaCl、 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4,30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 グルコース, 5 ナアスコルビン酸, 4 ナピルビン酸, 2 CaCl2·2H2O, および 2 MgSO4·7H2O. 1 N NaOH で pH 7.3-7.4 にチタリ酸.注意:NaCl、KClおよびNaH2PO4 は4°Cの10xの解決として入荷することができる。 記録用ACSFを準備する(mMで):122 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、24NaHCO 3、12.5グルコース、2 CaCl2·2H2O、および2 MgSO47H2O、2ナアスコルビン酸、4ナピルビン酸。1 N NaOH で 7.3-7.4 に pH を titrate pH.注意:NaCl、KClおよびNaH2PO4 は4°Cの10xのストックの解決で結合することができる。 2. スライス用ベンチの準備 氷の上にビーカー(150 mL)と2つのガラスペトリ皿(直径10cm)を準備し、新鮮な切断溶液でそれらを埋めます。カルボーゲンバブリング装置(穿穿管またはカルボーゲンシステムに接続された空気石)で溶液を酸素化しておいてください。注:ビーカーの溶液は、ペトリ皿は切断手順の間に使用される間、灌流のために使用されます。 ステンレス鋼の刃、丸みを帯びた先端ピンセット、細かい先端ピンセット、大きなはさみ、小さいはさみ、大きな金属ヘラ、薄い金属ヘラ、ブラシ、ビブラードームプレートとシアノアクリレート接着剤または毒性の低いn-ブチルエステルシアノアクリル酸接着剤を手術ベンチに装備します。氷の上のガラスペトリ皿の一つにステンレス鋼の刃とフィルターペーパーの一部を差し込みます。このペトリは、脳を切断するために使用されます.プラスチックペトリ皿の底に3本の平行線を引き、この皿を手術器具の近くに置きます。 公開されたプロトコル25に従って心筋灌流用のセットアップを準備します。 ビブラートメを準備し、ブレードホルダーに新しいブレードを取り付け、切断のパラメータ(水平面17°からのブレードの角度、ブレード発振振幅1.5mm、ブレード前方移動速度は約2mmmin-1、振動周波数は90Hz、断面厚は350μm)を設定します。ビブラートメトレーに氷冷切断液を充填し、一定の酸素化の下に保管します。注:私たちは、温度を下げるために冷却された新鮮な切断ソリューションに切断液の最初のバッチから作られた砕いた氷を追加します。スライスしながら、ブレードから氷を保つために注意してください。 一定の酸素化の下で切断液で満たされたインキュベーションチャンバーを準備する。チャンバーを温める湯(35°C)に入れます。注:インキュベーションチャンバーの例は、エドワーズとコナース(1992)26で見つけることができます。 貯蔵液で満たされたスライス貯蔵室を準備し、室温で、一定の酸素化の下でそれを保つ。組織が蛍光タンパク質または光活性化オプシンを発現する場合、例えば箱の中で、暗所にチャンバーを保つことが推奨される。注:複数の独立したウェルを持つ貯蔵室は、海馬のドーソベントラ軸に沿ってスライスのレベルを区別するのに便利です。カスタムメイドのチャンバーを構築することができます(図1D)。81x極低温バイアル収納ボックスからバイアルスペーサーグリッドを取り、ナイロンネットに底を接着します。5mLピペットプラスチックチップの上部1/3をこのグリッドの中央に挿入し、底部に約3cm突き出るようにします。このプラスチック製の先端は、グリッドのスタンドとして機能し、後で酸素化のための空気管を保持します。傾けたりぐらついたりできないように、スタンドを持つグリッドを円筒形のプラスチックボックス(シリンジフィルターの包装など)に挿入します。この貯蔵所は貯蔵の解決の250 mLを握る。 3. 海馬スライスの準備 ボンネットの下にあるイオブルラン(約0.5 mL)を使用して、箱室でマウスを麻酔します。呼吸が遅く規則的になるまで、マウスを休ませます (約 2~3 分)。つま先ピンチで痛みの応答がないのテスト。 25,27の公表されたプロトコルに続く氷上のビーカーから25mLの炭酸切断溶液を使用して心筋灌流を行う。このステップは、迅速に神経代謝を遅くするために急速に脳を冷却することをお勧めします. 大きなはさみを使用して動物の首を切り落とし、切断液を含む氷の上の冷却されたペトリ皿に頭を置きます。 頭蓋骨を露出させるために細かいはさみで皮膚を開きます。小さな側部切開を、頭蓋マグナムの両側の頭蓋骨の基部に入れさせる。次に、射手縫合糸に沿って、嗅球の上のナソ前頭縫合糸に達するまで、前門マグナムから始まる縫合糸に沿って切断する。下にある脳組織の損傷を避けるために矢頭切りの間にはさみを引き上げる。注:切断溶液に頭を沈めたままにしておくことは、血液からそれをクリアするのに役立ち、温度を下げる。 丸みを帯びた先端のトゥイザーを使用して頭頂部骨を引き上げて脳を露出させます。あまりにも手に入れ、髄液を取り除くために注意を払います。残した場合、彼らは抽出中に脳に損傷を与えることができます。 小さなへらを使って脳を2番目のペトリ皿にそっとすくい取ります。 冷やされたブレードを使用して、縦方向の裂け目に沿って脳を半分にカットします。 大きなへらを使用して、切断液から1つの半球を持ち上げ、プラスチックペトリ皿に持ち上げます。半球が内側の表面に横たわっている場合、 図1Bに示すように、頭頂皮質を平行線の1つに合わせて、2番目のカットの基準を持たせる。 図1Bに示すように、半球の腹側部分で2回目の切削を行い、ブレードを平行に配置して表面を得て、後で脳を標本ホルダーに接着するために使用する(次のステップを参照)。ガラスシャーレの酸素切断溶液に半球を戻し、第2半球で同じ手順を実行します。 接着剤を使用してビブラートメ標本ホルダーに切りたての腹側で半球を接着します。切断液を半球に数滴入れて接着剤を固め、標本ホルダーをビブラートメトレーに移動します。このようにして、スライスは、側腹筋から腹側海馬に進みます。 最初の 1 つまたは 2 つの非トランスバーサル スライス (図1C、ii-iii)を削除して、対象領域が表示され、スライスの収集を開始します。注:非トランスバーサルが使用できる、健康的なスライスは、スライス手順の開始時に、裏海馬から得ることができます(図1C、ii-iii)。各スライスのコレクションは約3〜4分必要です。腹側海馬の代わりに後側から切断を開始することで、約10分を節約し、後部スライスの生存率を向上させます。 プラスチックピペット(先端の狭い端を切り取る)で、各スライスをインキュベーションチャンバー(35°Cの切断液を含む)に移し、12分間休ませます。温かい切断溶液の短い回復期間は、Ting et al. (2014)28.に報告されているように、初期神経腫脹を大幅に減少させる。次にブラシを使用して、スライスを貯蔵室(RTで貯蔵溶液を含む)に移し、実験を開始するまで休ませる。 4. 全細胞記録とバイオシチン充填 注: 全細胞パッチクランプ記録の説明は、良好なバイオシチン充填を得るのに役立つ主要なステップに限定され、一般にACSFのニューロンに適用可能です。電気生理学的記録の手順に関する詳細については、他のいくつかのプロトコルを参照してください29,30. 記録するパラメータに従って適切な細胞内溶液を選択します。一例として、現在のクランプ測定では、グルコン酸カリウムベースの溶液(mM)を使用することができます:135 K-グルコネート、3 KCl、10 HEPES、0.2 EGTA、10ホスホクレアチン-Na2、4MgATP、0.3 Na2-GTP。pHを1 M KOHで7.3に調整します。オスモルリティは、3-5 mg/mLバイオシチンが添加されると、約285〜290 mOsmol/kgでなければなりません。メモ:記録中のニューロンの形状を監視するために、1 mMアレクサフルオールヒドラジドの0.3-0.5 μL/mLを細胞内溶液に加えることができます。この場合、バイオシチンの啓示のために覚えておき、アレクサ色素色をストレプトアビジンに結合した蛍光プローブと一致させる。 厚層のホウケイ酸毛細血管から≤1 μmの先端径および3-5 MΩ抵抗のパッチクランプ電極を準備します。 RTまたは35-37 °Cで2.5-3 mL/minの速度でパッチクランプ設定の灌流システムを開始し、U字型のアンカーでチャンバー内のスライスを固定します。 関心のある脳領域を特定し、スライスの表面の下に少なくとも30〜50μmの相馬を持つ健康なニューロンを選択します。注:健康なニューロンの相馬は滑らかな表面を持ち、膜の境界はわずかに対照的です。不健康なニューロンの相腫は、縮小して、非常にコントラストまたは腫れと半透明に見えます. AgCl電極の先端が覆われるまで、細胞内溶液を用いてガラスピペットをロードします。ピペットを記録チャンバーの溶液に移動し、ガラス電極の先端をクリアしておくために光の正圧を適用します。注:溶液にAlexa染料が含まれている場合、圧力を視覚的に制御して、チップから放出される蛍光溶液の量を調整することができます。最小限の圧力は、細胞の周りの組織の染色を回避します。 斜めの角度から細胞に近づき、ギガシールを形成する際に相馬面の最初の1/3以内に接触を確立します。圧力を解放し、保持電位を65mVにゆっくりと移動し、口による穏やかな吸引を施してギガシール形成を容易にする。 全細胞構成を確立するには、膜を破壊するために強く、短い吸引を適用する。保持電流が100pAを超えて増加している場合、またはアクセス抵抗が30MΩを超えて増加する場合、ニューロンが50mVより多く脱分極した膜電位を有する場合、記録を破棄する。 記録後(ソマタと樹状突起の十分な充填のために少なくとも15分が推奨されます;1時間までの複雑な軸索の充填には31が必要です)は、電極を慎重に取り外します。この端部には保持電位を0mVに設定し、外出パッチ構成を得るなど、アプローチとは反対の方向にピペットをゆっくりと引き込んでギガシールを再形成しよう。注:細胞内溶液中のAlexa色素の存在は、神経細胞表面からのピペットの視覚的に導かれた除去を助ける。細胞の核がピペット先端と接触していない場合、シールを改定する迅速な方法は、ピペットを組織から対角線上および高速で上方に引き出す。もし、膜の核または一部が先端の中に存在する場合、原形質膜を破壊する危険性がある。この場合、わずかな正圧適用と横方向の動きが役立ちます。 セルの位置とスライスの方向を確認します。固定後、スライスの正確な方向と充填された細胞の完全性を蛍光顕微鏡で確認することができます。 5. 免疫染色、画像取得、形態再構成 記録後、スライスを24ウェルプレートに移し、0.1Mリン酸緩衝生理食塩分(PBS)でパラホルムアルデヒド(PFA)4%に固定します。使用する一次抗体の感度に従って、RTで、または4°Cで一晩で60分間インキュベートする。スライスは0.1 M PBSと0.02%NaN3に保存することができます。注意:PFAは有毒です。ボンネットの下で使用してください。 確立されたプロトコル32、33に従って記録の1週間以内に免疫染色およびバイオシチンの啓示を行う。注: 樹状および軸索プロセスの完全性を維持するためにスライスの再切除を回避する手順を使用します。しかし、抗体が組織に浸透する必要があるため、この手順はより長いインキュベーション時間を必要とします。実験を行う前に、抗体を組織に最適に浸透させる時間をテストすることをお勧めします。 Zスタックとタイルスキャン機能を備えた共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。 フィジーの画像J34を使用して形態学的再建を行います。注:いくつかの画像ファイル形式は、 バイオフォーマット プラグインを使用してプログラムにインポートすることができます。デンドライトと軸索の再構築には、単純な Neurite トレーサー (STN) プラグイン35 を使用することをお勧めします。シンプルで明確なチュートリアルは、https://imagej.net/SNT と http://snyderlab.com/2016/05/25/tracing-neurons-using-fiji-imagej/ で利用可能です。トレーシングデータ(.traces)を含むファイルは、圧縮されていない状態で保存されている場合、テキストファイルに変換し、Matlabまたは他のソフトウェアで開いてテキストデータ処理を行うことができます。