在穆林真菌败血症模型中用于高效尾静脉注射的当代加热/抑制装置

所有涉及尾静脉注射和使用加热/抑制装置的动物协议均经过当地机构动物护理委员会 （IACUC） 的审查和批准。 1. 准备 在居住环境中对动物进行至少1周的适应，并允许食物和水。注：对于这种注射技术的大多数新用户来说，带有白色或浅色毛皮的动物菌株可能更可取，因为尾静脉通过皮肤很容易看到。深色小鼠（例如C57BL/6）或大鼠（例如挪威布朗）的深色菌株有深色染色尾巴，导致与静脉的颜色对比较弱。强烈建议新用户接受充分培训，直到达到熟练程度。 尾静脉注射剂 无能地准备所有测试代理和解决方案。在管理生物体或细胞材料时，在加工的所有步骤中采取预防措施，以保持无丙原的条件。 仅使用普通盐水（0.9% w/v 氯化钠）或平衡盐溶液（如磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 作为尾静脉注射的车辆。注意：切勿使用水、油或粘性溶液，因为存在血管损伤的潜在风险。由于血液的缓冲作用和啮齿动物的快速血流量，广泛的pH值（4.5-8.0）是可以容忍的。然而，高酸性或碱性溶液可能导致注射部位不必要的组织损伤，应避免。 将注射的体积和频率限制在最低限度。注射前在体温下使用小鼠和大鼠推荐的体积（分别为≤200微升和≤500微升），以尽量减少对动物的压力。 确保每个注射器和针头的制备液均无溶液中的气泡：如果存在气泡，则完全清除它们，以防止栓塞的风险。注：通常，1 mL注射器与27G，1/2针是足够的大多数尾静脉注射。 使用当地 IACUC 要求的适当的个人防护装备 （PPE），至少配备一次性或专用礼服、乳胶或亚硝酸盐手套。在进行尾静脉注射时，强烈建议使用安全眼镜。 加热和约束装置 使用前仔细检查所有组件，以确保设备没有任何缺陷（图1）。 加热设备初始化 （图 2A） 将加热装置放在干净的平台式台面上，并打开设备电源。确保恒温器功率指示灯呈绿色照明。将床上用品放在加热室内，以保持区域干燥并保持热量。 约束装置设置 （图2B） 将约束单元与加热单元放在一起，并确定动物的相应锥体大小。如有必要，手动调整柔滑铝锥的基宽，为动物提供足够的约束。或者，用定制的模型替换圆锥体，以容纳不同体型的小鼠或大鼠。 2. 尾静脉注射 设备调整 设置内部温度 使用控制表盘，将恒温器设置在所需的温度下。确保加热器指示灯呈红色，灯泡亮起。灯泡照明（加热）时，小心监控内部温度显示。恒温器在达到目标温度后自动灭活灯泡，大约在 10 到 15 分钟内。注意：设置高于环境温度的温度会激活加热器。一般来说，建议在标准病毒条件下的住房温度不同，从20至26°C不等，而中性（即舒适）温度的实验鼠被认为是在30至32°C42之间。因此，建议加热室的内部温度略高于热中性，大约在 32°36 °C。 切勿将恒温器设置在体温之上。 定位约束平台 使用高度调整旋钮，将圆锥体高度调整为用户的最佳水平。 热处理 （图3A） 一旦达到目标温度（32°36°C），轻轻地将动物从笼子转移到暖室。注意：5 至 10 分钟的热处理足以诱导血管变异，提高尾静脉的可见性。然而，在手术过程中，动物可以安全地被关在热调节室中（通常为20至30分钟，没有体温过高的迹象）。加热室可以安全地容纳4至6只老鼠或一只老鼠。 监测动物是否有急性热应激的迹象（例如，快速呼吸、嗜睡、跳跃逃生行为）。警告：出现体温过高迹象的动物应返回笼中并受到监测，直到它们在重复使用之前恢复正常活动。如果这是因为内部温度超过最佳范围，请确保加热设备关闭。 注射步骤 将动物从尾巴底部抬起来，从加热室中取出。将动物引入约束单元的锥体开口。注意：切勿将老鼠从尾端抬起来：这可能导致严重的伤害。其他处理方法应用于肥胖或怀孕的小鼠28。 当动物用前体抓住圆锥体的远边缘时，轻轻地向后拉尾巴，通过开阔的缝隙穿过尾巴。将动物的后端固定在圆锥体底部，一条后腿从圆锥体中伸出，使横静脉显示在 12 点的位置。任何后腿都可以突出，因为有两个侧静脉，每侧一个（图3B）。 用拇指和食指之间的非主导手抓住中到三分之二长度的尾巴，在横静脉上施加轻微的张力，以保持尾部定位和血管增生。注：通过热处理增强扩张静脉的可见性，使用户能够快速确定注射部位以获得最佳效果（图4）。 用纱布海绵擦拭注射部位的皮肤，或用 70% 酒精滋润垫。尽可能轻柔和快速地清洁，以避免对尾部发炎。注：这一程序可以由机构IACUC酌情省略。 用占主导地位的手握住注射器，将针头平行于尾部。将针头插入血流方向，以 10+15° 角（图 5A+B）向上倾斜，通过穿透 2+4 mm（图 5C+D）进一步进入静脉的流明。慢慢注入溶液。注：如果注射成功，则不应感觉到柱塞上的阻力，并且可以看到液体通过静脉移动。如果在注射部位上方出现阻力或白色水泡，请取出针头，并在原始针位上方的部位尝试第二次注射。不要尝试在初始注射部位下方注射，因为液体会通过初始部位释放。如果注射一个侧静脉不成功，将动物重新定位到另一侧，并在逆静脉上进行更多的尝试。尝试的最大次数将取决于尝试注射沿静脉和肿胀可能发生在错过尝试。咨询国际民航联合会关于误射和相关伤害的机构条例。 取出针头，用拇指牢牢按压，以防止注射溶液和/或血液回流。继续使用干净的纱布/擦拭或组织进行温和压缩，直到出血停止（图6）。 将动物送回笼子，并监测至少5分钟。确保动物恢复正常活动，不进一步出血。 3. 真菌血流感染和败血症的穆林模型 鼠标菌株 根据机构推荐的指南，瑞士雌性韦伯斯特在6周大时繁殖了小鼠。或者，使用近亲繁殖/转基因菌株（例如，C57BL/6 背景）使用此协议与改良的内在球菌（见注）。注（见讨论细节）：由于深色色素的尾巴，有深色毛皮的小鼠的尾部静脉往往比有较浅毛皮的小鼠更不明显（图4）。不同小鼠菌株对真菌败血症/致命性的影响各不相同。使用瑞士韦伯斯特以外的小鼠菌株可能需要额外的协议优化，考虑可能影响宿主免疫状态的相关因素（例如遗传背景、年龄、性别、体型）。例如，C57BL/6小鼠的致命挑战通常需要更高的脑球菌（高达10倍）才能达到瑞士韦伯斯特小鼠的死亡率水平。 微生物 对于致命的挑战 （败血症）， 条纹冷冻库存 的念珠菌 株 DAY185 （或选择菌株） 到萨博劳德克斯特罗斯阿加， 并在 30 °C 孵育 2 天. 将单个菌落转移到 10 mL 酵母提取物 – 辣椒 – 德克斯特罗斯肉汤中，并在 30 °C 下摇晃时将培养物转移到 18 小时的静止生长阶段。 接种解决方案 在致命挑战的那天，收集肉汤培养物，用无菌PBS离心（800× 克）清洗颗粒3次。 通过尝试蓝色染料排除来识别可行的酵母细胞，并使用血细胞计进行列举。在室温下将细胞浓度调整到 1 x10 6 细胞/mL 无菌 PBS 中。注：每只动物将收到100微升的接种液。准备过量的输液（>500微升），以允许注射过程中的潜在损失。最后的接种是每只小鼠1×105 个细胞。通过相应地调整细胞浓度，可以增加高达 200 μL 的接种量。警告：注射前必须在室温下保存真菌接种液。将接种液加热到体温可能会诱发从酵母细胞到催眠细胞的形态变化。相反，冷溶液的施用可以迅速降低动物的体温，应避免。 静脉接种 加热动物，并按照第2节的程序诱导血管变异。 使用 1 mL 注射器和 27 G 1/2 英寸针头将 100 μL 的接种液注射到尾静脉中。 接种后监测 监测动物是否有以下败血症引起的发病率迹象：i） 毛皮方面（例如， 平滑、褶皱）、ii） 活动（例如，自由移动、无反应）、iii） 姿势（如驼背、僵硬）、iv）行为（例如，缓慢、无移位）、v） 胸部运动（如正常呼吸、呼吸困难）、vi）眼睑（如打开、关闭）43。 败血症评分 根据经修改的败血症（M-CASS）小鼠临床评估分数，在每个类别的四分评分表中对观察到的发病率进行评分：0，正常：1、温和：2、中度：3，严重43。 可选协议：预防真菌败血症 在致命挑战前14天，用Canada dubliniensis菌株Wé284或衰减的C.藻类菌株（如+efg1/+cph1突变体（每只小鼠1×105细胞）给小鼠接种疫苗，如第3.2 3.4节（代替C.藻类DAY185）。 如第3.2-3.4节所述，对接种疫苗的小鼠进行致命挑战，并监测第3.5-3.6节中描述的败血症引起的发病率的迹象。