Wij bieden een gedetailleerd protocol voor elektroporatie-gemedieerde RNA interferentie in insecten van de orde Odonata (libellen en jonkvliegen) met behulp van de blauwstaartdamselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) en de pied skimmer libelle (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).
Libellen en jonkvrouwen (orde Odonata) vertegenwoordigen een van de meest voorouderlijke insecten met metamorfose, waarin ze hun habitat, morfologie en gedrag drastisch veranderen van aquatische larven naar terrestrische / luchtvolwassenen zonder popstadium. Odonata volwassenen hebben een goed ontwikkelde kleur visie en tonen een opmerkelijke diversiteit in lichaamskleuren en patronen over geslachten, stadia en soorten. Terwijl vele ecologische en gedragsstudies op Odonata zijn uitgevoerd, zijn de moleculaire genetische studies schaars hoofdzakelijk toe te schrijven aan de moeilijkheid in het toepassen van gen functionele analyse op Odonata geweest. Bijvoorbeeld, RNA interferentie (RNAi) is minder effectief in de Odonata, zoals gemeld in de Lepidoptera. Om dit probleem op te lossen, hebben we met succes een RNAi-methode opgezet in combinatie met in vivo elektroporatie. Hier bieden we een gedetailleerd protocol met een video van de elektroporatie-gemedieerde RNAi-methode als volgt: voorbereiding van larven, identificatie van soorten, voorbereiding van dsRNA/siRNA-oplossing en injectienaalden, ijskoude anesthesie van larven, dsRNA/siRNA-injectie, in vivo elektroporatie en individueel fokken tot het ontstaan van volwassenen. De elektroporatie-gemedieerde RNAi methode is van toepassing op zowel damselflies (suborder Zygoptera) en libellen (suborder Anisoptera). In dit protocol presenteren we de methoden voor de blauwstaartdamselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) als een voorbeeld van damselfly soorten en de pied skimmer libfly Pseudothemis zonata (Libellulidae) als een ander voorbeeld van libelle soorten. Als representatieve voorbeelden tonen we de resultaten van RNAi gericht op de melanine synthese gen multicopper oxidase 2. Deze RNAi-methode zal het begrijpen van verschillende genfuncties die betrokken zijn bij metamorfose, morfogenese, kleurpatroonvorming en andere biologische kenmerken van Odonata vergemakkelijken. Bovendien kan dit protocol in het algemeen van toepassing zijn op niet-modelorganismen waarin RNAi minder effectief is in genonderdrukking als gevolg van de inefficiëntie en lage penetrantie.
Libellen en jonkvrouwen (de orde Odonata) behoren tot de meest voorouderlijke groepen insecten die “metamorfose” vertonen1,2. Door metamorfose veranderen ze hun habitat, morfologie en gedrag drastisch van aquatische larven naar terrestrische/antennevolwassenen3. Odonata volwassenen hebben een goed ontwikkelde kleur visie en vertegenwoordigen een opmerkelijke diversiteit in lichaamskleuren en patronen over geslachten, stadia, en soorten3,4,5. Terwijl veel ecologische en gedragsstudies op Odonata zijn uitgevoerd6,7, moleculaire genetische studies zijn vooral belemmerd door de moeilijkheid bij de toepassing van gen functionele analyse op Odonata.
De conventionele RNA interferentie (RNAi) methode, waarbij dubbelstrengs RNA (dsRNA) wordt geïnjecteerd om de functie van het gen van belang8te onderdrukken, bleek niet effectief te zijn bij Odonata insecten9, zoals gemeld in Lepidopteran insecten10. Aan de andere kant, eerdere rapporten hebben gesuggereerd dat elektroporatie-gemedieerde RNAi effectief is in Lepidopteran soorten, vooral in epidermale weefsels11,12,13. We hebben onlangs vastgesteld dat de elektroporatie-gemedieerde RNAi werkt effectief in de kleine libelle Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)9, maar N. pygmaea is een relatief zeldzame soort en dus niet geschikt voor moleculaire genetische studies.
De meeste Odonata soorten zijn ingedeeld in een van de twee suborders, Zygoptera (damselflies) of Anisoptera (echte libellen)3. Hier richtten we ons op de blauwstaartdamselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Figuur 1A) als representatieve Zygopteran soort en de pied skimmer libelle Pseudothemis zonata (Libellulidae; Figuur 1B) als representatieve Anisopteransoort. De twee soorten behoren tot de meest voorkomende Odonata soorten in natuurlijke en stedelijke vijvers in Japan, met inbegrip van die in Tsukuba City, en we kunnen verzamelen vele larven van de twee soorten in het veld. Onlangs hebben we een laboratoriumhouderijsysteem voor individuele larven van I. senegalensisopgezet, waardoor de ontwikkeling en morfogenese van de Odonata-larven in detail konden worden gecontroleerd14.
In dit rapport bieden we een verfijnde methode en een videoprotocol voor de elektroporatie-gemedieerde RNAi in I. senegalensis es P. zonata. In Japan, I. senegalensis es Ischnura asiatica, die genetisch dicht zijn, worden vaak sympatrisch15gevonden , en ze zijn moeilijk te onderscheiden in larven16. We beschrijven ook hoe twee Ischnura-soorten kunnen worden onderscheiden door beperking fragment lengte polymorfisme (RFLP).
Voor de evaluatie van de effectiviteit van de elektroporatie-gemedieerde RNAi, selecteren we multicopper oxidase 2 gen (MCO2; ook bekend als laccase2) als een representatief doelgen, vanwege het zichtbare fenotype van bleker cuticula kleur bij knockdown van de genexpressie9. MCO2 staat bekend als essentieel voor het verduisteren van de opperhuid bij een verscheidenheid van insectensoorten17,18.
Letaliteit van RNAi behandeling
We ontdekten dat de letaliteit van de RNAi-behandeling sterk afhangt van de opfokgeschiedenis en conditie van de Odonata-larven. De larven kort na de inzameling in het veld zijn over het algemeen gezond en vertonen lage sterftecijfers na de elektroporatie-gemedieerde RNAi-behandeling. Daarentegen hebben de larven die gedurende een lange periode in het laboratorium worden gekweekt (bijvoorbeeld een maand) de neiging om lage slagingspercentages van volwassen opkomst te lijden. In I. senegalensis, in plaats van de larven verzameld in het veld, de larven gefokt in het laboratorium van eieren kunnen worden gebruikt14, maar de slagingspercentages van RNAi met behulp van de laboratorium-gekweekte larven hebben de neiging om aanzienlijk lager (veel mensen stierven tijdens metamorfose) dan die met behulp van het veld verzamelde larven. Bovendien zijn frequente larvevoeding en schoon water grootbrengen belangrijk voor het verhogen van de slagingspercentages van volwassen opkomst en het verminderen van de dodelijkheid van de RNAi-behandeling.
Efficiëntie van de RNAi-behandeling
Zoals hierboven beschreven, vertoonden de niveaus van RNAi-fenotype, namelijk grootte en locatie van de cuticulaontkleuring, vaak aanzienlijke variatie tussen personen die aan dezelfde RNAi-behandeling werden onderworpen (bijvoorbeeld figuur 4),maar de niveaus van de fenotypische penetranteinatie lijken opmerkelijk verschillend te zijn tussen de Odonata-soorten. De waargenomen fenotypische regio’s waren groter en prominenter in I. senegalensis (Figuren 4-5) dan in P. zonata (Figuur 6) en N. pygmaea9. Dit verschil kan te wijten zijn aan de dikte van de nagelriem op het larveoppervlak, gezien het feit dat de cuticula van I. senegalensis dunner is dan de cuticula van P. zonata es N. pygmaea). Voor zover wij onderzochten, werd geen duidelijk verschil tussen de effecten van siRNA en dsRNA(figuur 4, tabel 1) erkend.
Geschikte ontwikkelingsfase voor RNAi
Opgemerkt moet worden dat een goede larve enscenering belangrijk is voor het efficiënt uitvoeren van RNAi. Remming van volwassen pigmentatie werd veroorzaakt door MCO2 RNAi vóór het stadium D (ongeveer 3 dagen voor de opkomst van volwassenen), wat in overeenstemming is met het vorige rapport over N. pygmaea9. De RNAi-fenotypes die werden waargenomen wanneer ze in de stadia C en D werden geïnjecteerd, waren minder opvallend dan de rnai-fenotypes die in de stadia A en B werden behandeld, wat erop wijst dat de stadia C en D te laat kunnen zijn om de genexpressie voldoende te onderdrukken. De juiste timing voor RNAi-behandeling is afhankelijk van de timing van genexpressie, en het MCO2-gen vertoont tijdelijk hoge expressie tijdens volwassen opkomst9, zoals bij andere insecten17,18. In de stinkbug Plautia stali, RNAi knockdown van MCO2 gen werd waargenomen vanaf dag 4 na injectie27, wat overeenkomt met de huidige resultaten.
Onze vorige studie over I. senegalensis toonde aan dat, na de fase B, dagen tot volwassen opkomst vertonen relatief kleine variatie onder de meerderheid van de laatste instar larven, wat suggereert dat het stadium B kan overeenkomen met het begin van het proces in de richting van volwassen opkomst, waarna de ontwikkelingsprocessen voor metamorfose te werk gaan op een vooraf vastgestelde en gecoördineerde manier14. Morfologische afwijkingen veroorzaakt door wonden werden vaak waargenomen wanneer de larven werden behandeld in de stadia C en D (Figuur 7B, 7C). Dit is waarschijnlijk geassocieerd met een dramatische progressie van metamorfose tijdens deze stadia, wat suggereert dat RNAi behandeling moet worden vermeden vanaf het stadium C en op. Samengevat raden we aan om de uiteindelijke instarlarven in het stadium A of B (of in het stadium voordat de larvevleugels aanzienlijk uit te breiden) moeten worden gebruikt voor RNAi-experimenten.
Nut en superioriteit van elektroporatie-gemedieerde RNAi-methode
De conventionele RNAi is een eenvoudige en krachtige experimentele methode, maar sommige insectenlijnen zoals vlinders10, bladluizen28 en libellen9 vertonen een lage RNAi-efficiëntie, waarvoor het opzetten van genfunctieanalyse een grote uitdaging is. In deze studie ontdekten we dat elektroporatie-gemedieerde RNAi lokale genonderdrukking bij libellen kan veroorzaken met bijna 100% efficiëntie, althans bij opperhuid, indien behandeld in passende ontwikkelingsstadia(tabel 1). Onlangs zijn crispr/cas9-gebaseerde gen knock-outs met succes toegepast op een verscheidenheid van insecten, die een krachtig moleculair genetisch hulpmiddel voor niet-model organismen29. Hier wijzen we er echter op dat CRISPR/Cas9 zeker geweldig is, maar de elektroporatie-gemedieerde RNAi-methode kan in sommige opzichten superieur zijn aan CRISPR/Cas9.
Ten eerste kan in de elektroporatie-gemedieerde RNAi-methode het lichaamsgebied waar RNAi-fenotypes verschijnen, gemakkelijk experimenteel worden gecontroleerd door de positie van de positieve elektrode bij elektroporatie. Bovendien, aangezien het gebied waar de genexpressie wordt onderdrukt beperkt is rond het gebied waar de positieve elektrode werd geplaatst, kunnen de RNAi fenotypes gemakkelijk worden vergeleken met de controlefenotypes naast elkaar in dezelfde persoon. Ten tweede, in vergelijking met CRISPR / Cas9 methode waarbij geïnjecteerde eieren moeten worden gefokt tot volwassenheid om de knock-out fenotypes te observeren, de elektroporatie-gemedieerde RNAi is superieur in die zin dat het gen knockdown fenotypes kan meestal worden waargenomen in veel kortere tijd. Zo duurt het drie tot vier maanden voor I. senegalensis en een tot twee jaar voor P. zonata van eieren tot volwassenen14,30. Echter, om RNAi fenotypes te observeren binnen de volwassen opperhuid, duurt het minder dan een maand van dsRNA-injectie in de uiteindelijke instarlarven in het stadium B tot volwassen opkomst voor zowel I. senegalensis als P. zonata (Figuur 7). Ten derde, de elektroporatie-gemedieerde RNAi methode met zich meebrengt dsRNA injectie in grote larven, die gemakkelijker is dan micro-injectie in kleine eieren die nodig zijn voor CRISPR / Cas9 methode. Bovendien is de elektroporatiegemedieerde RNAi van toepassing op insectensoorten waarvan de nieuw gelegde eieren moeilijk te verzamelen zijn. Bijvoorbeeld, vrouwtjes van P. zonata leggen eieren op drijvende planten op het wateroppervlak tijdens de vlucht, en dus is het moeilijk om hun eieren te verzamelen, zowel in het veld en in het lab. Daarom verwachten we dat dit protocol algemeen van toepassing kan zijn op niet-modelorganismen waarin de conventionele RNAi-methode niet efficiënt werkt.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Minoru Moriyama voor technisch advies en ondersteuning, Bin Hirota en Ryutaro Suzuki voor het verzamelen van Odonata larven, en Misa Shinya voor nuttige opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Numbers JP18J21561 to GO en JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 en JP20H04936 naar RF.
12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
DraI | Takara Bio | 1037A | |
Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
Hand net | HOGA | IS33-3B | |
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
Laboratory Jack (150×150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |